1、目的:提取人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165(VEGF165)基因序列，構(gòu)建VEGF165慢病毒載體，轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，利用WesternBlot檢測(cè)其在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)情況，尋求基因手段預(yù)防硬膜外瘢痕的方法。
　　 方法:
　　 (1)調(diào)取VEGF165基因序列:從基因庫(kù)找到VEGF165的基因序列，設(shè)計(jì)引物attB1-k-VEGF165-F,VEGF165-attB2-R。
　　 (2)目的載體的構(gòu)建:

2、利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法將設(shè)計(jì)好的引物，模板DNA，底物等等進(jìn)行反應(yīng)，得到VEGF165DNA，再利用Gateway技術(shù)將VEGF165基因序列克隆至入門載體，進(jìn)而克隆至目的載體，從而得到含有VEGF165序列的表達(dá)載體。
　　 (3)慢病毒的包裝:取細(xì)胞狀態(tài)良好，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293FT細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，培養(yǎng)過(guò)夜。第二天轉(zhuǎn)染前去除舊的培養(yǎng)液，加入5mL新鮮的含10％血清DMEM培養(yǎng)液等待轉(zhuǎn)染。制備DNA-Lipofec

3、tamine2000復(fù)合物，復(fù)合物里含有pLV/helper-SL3，pLV/helper-SL4，pLV/helper-SL5，目的載體，培養(yǎng)基等等。將DNA-Lipofectamine2000復(fù)合物一滴一滴地添加到293FT細(xì)胞中，輕輕地前后搖晃培養(yǎng)皿以混勻復(fù)合物。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收集培養(yǎng)上清進(jìn)行濃縮;加入10ml新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后72小時(shí)再次收集濃縮;分裝好的病毒放置-80℃保存。測(cè)定滴度。
　　 (4)骨髓干細(xì)胞

4、的提取和培養(yǎng):取SPF級(jí)4-5周SD雄性大鼠一只，取大鼠股骨和脛骨的骨髓，早期培養(yǎng)原代接種后前三次換液，每24小時(shí)換一次。由于細(xì)胞前期增殖極其緩慢，所以不需要按照常規(guī)的操作進(jìn)行，大概5-7天進(jìn)行換液。前期的維持培養(yǎng)過(guò)程大概需要40-60天，期間的換液以5-7天左右換一次。待骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞純化后，傳代一次，即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
　　 (5)WesternBlot檢測(cè):待檢測(cè)的樣品分別為:大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，轉(zhuǎn)染了eGFP的大鼠間充質(zhì)

5、干細(xì)胞，轉(zhuǎn)染了VEGF165的間充質(zhì)干細(xì)胞。提取蛋白后，用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定樣品蛋白總濃度和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，再進(jìn)行蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移以及膜的封閉。最后進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)和顯色，置于FiuorchemHD2凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察，拍照。
　　 結(jié)果:利用分子生物學(xué)技術(shù)成功構(gòu)建慢病毒VEGF165載體，VEGF165組測(cè)定的病毒滴度為4.7×107，eGFP組為6×107。轉(zhuǎn)染骨髓干細(xì)胞48小時(shí)后熒光顯微鏡下觀察VEGF165