1、背景
　　 因創(chuàng)傷、腫瘤及關(guān)節(jié)翻修術(shù)等原因所致的骨缺損是當(dāng)前骨外科常見(jiàn)的問(wèn)題之一。自體骨、異體骨和人工骨是目前骨缺損的主要修復(fù)材料來(lái)源。自體骨移植因面臨二次手術(shù)、來(lái)源不足、傷口部感染等因素，其臨床應(yīng)用受到了限制;同時(shí)，異體骨移植也因存在免疫排異反應(yīng)、疾病傳播及倫理道德等限制，無(wú)法在臨床廣泛應(yīng)用。構(gòu)建活性人工骨修復(fù)材料為骨缺損的修復(fù)提供了方向，而種子細(xì)胞和生物活性因子則是構(gòu)成活性人工骨修復(fù)材料的重要要素。
　　 活性人工骨

2、修復(fù)材料研究對(duì)于種子細(xì)胞的要求主要為:①適合臨床應(yīng)用需要，即來(lái)源廣泛、取材簡(jiǎn)便、創(chuàng)傷小;②誘導(dǎo)后的細(xì)胞移植入體內(nèi)后無(wú)免疫排斥反應(yīng);③具有多向分化的潛能，在體外擴(kuò)增達(dá)到所要求的細(xì)胞數(shù)量時(shí)保持其成骨表型，在體內(nèi)外誘導(dǎo)因子的作用下可以擴(kuò)大增殖。眾所周知，干細(xì)胞具有多向分化性，控制體外培養(yǎng)條件可使干細(xì)胞向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞等方向分化。干細(xì)胞包括組織干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞的使用面臨著很多倫理學(xué)和安全性的問(wèn)題，而且體外培養(yǎng)條件要求十分嚴(yán)格

3、，其應(yīng)用存在很大的局限性。相比較而言，組織干細(xì)胞可能是近期內(nèi)能夠應(yīng)用于骨組織工程尤其是臨床應(yīng)用的最佳種子細(xì)胞來(lái)源，目前比較明確的能夠向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的組織干細(xì)胞主要是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有多分化潛能，可分化成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞等，增值能力強(qiáng)，來(lái)源廣泛，取材方便，供區(qū)損傷小，因而倍受人們的關(guān)注。
　　 生物活性因子在促進(jìn)骨修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮極其重要的作用，骨缺損愈合是骨組織完全性再生的過(guò)程，其組織學(xué)過(guò)程伴隨著復(fù)雜的分子生

4、物學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制，大量活性因子在不同的骨愈合階段發(fā)揮不同的作用，而促進(jìn)新骨形成和局部血運(yùn)重建的活性因子顯得尤為重要。影響新骨形成研究較為深入的生物因子為骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone Morphogenetic Proteins，BMPs），BMPs對(duì)骨原細(xì)胞的分化起決定性作用，是促進(jìn)成骨的主要因子。BMPs家族成員較多，至今已有40多種BMP蛋白被成功地分離。其中BMP2是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)超家族中的多功能細(xì)胞因子，可在骨損傷局部及異

5、位促進(jìn)細(xì)胞增殖，提高其堿性磷酸酶活性，也是唯一能夠單獨(dú)在異位誘導(dǎo)成骨形成的信號(hào)分子，這使其在骨關(guān)節(jié)疾病特別是骨折、骨缺損的臨床治療中具有極大的潛在應(yīng)用價(jià)值。研究表明BMP2是BMP家族成員中骨誘導(dǎo)作用最強(qiáng)的因子，大量實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了將BMP2直接或通過(guò)載體局部應(yīng)用可促進(jìn)骨形成。同時(shí)，骨組織工程中骨血管化也是一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其作用貫穿于整個(gè)骨再生修復(fù)過(guò)程，充足的血供不僅有利于種子細(xì)胞的存活、增殖和分化，同時(shí)還可加速新骨的形成，從而加快骨缺損的修

6、復(fù)。促血管化的生物因子有數(shù)十種，Vascular Endothelial Growth Factor(VEGF)是目前公認(rèn)為作用最強(qiáng)，特異性最高的一種的促血管生成因子，VEGF在血管生成中具有直接和間接的調(diào)控作用，一方面可以刺激EC增殖、遷徙，另一方面可以增加血管的通透性，使許多血漿蛋白滲出血管外，這對(duì)改造局部的細(xì)胞外基質(zhì)以適應(yīng)血管生成具有重要作用。VEGF還可以刺激成骨細(xì)胞的分化增殖，加速骨的形成和重塑。其中VEGF165是一種分泌性

7、生長(zhǎng)因子，廣泛地存在于多種組織細(xì)胞中，不僅具有促進(jìn)血管生成活性，而且其表達(dá)產(chǎn)物是可溶性的，表達(dá)后可從細(xì)胞中分泌出來(lái)，擴(kuò)散性強(qiáng)，易到達(dá)靶細(xì)胞，能很好的發(fā)揮生物學(xué)活性。
　　 自從發(fā)現(xiàn)BMP2和VEGF165都參與骨形成，單純運(yùn)用生物活性因子于局部發(fā)揮作用面臨著體內(nèi)半哀期短、容易被體液沖走或稀釋的難題，難保持局部有效治療濃度?；蚣夹g(shù)的發(fā)展為我們提供了有效的手段，基因治療是維持骨缺損局部生物活性因子有效治療濃度最具有希望的一種方法。

8、目前用作基因治療的載體主要分為非病毒載體及病毒載體，病毒載體中運(yùn)用較多的為慢病毒載體，慢病毒(Lentivirus)是一類免疫缺陷性病毒，是由這些病毒引起慢性感染而得名。慢病毒載體也是一類逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它既能夠感染分裂細(xì)胞，也能夠感染非分裂細(xì)胞，由于慢病毒載體能夠感染大多數(shù)非分裂細(xì)胞，以及具有高效地整合和穩(wěn)定地表達(dá)目的基因于靶細(xì)胞的能力，所以已被廣泛應(yīng)用于各種基因治療實(shí)驗(yàn)研究。一些科學(xué)家推測(cè)，VEGF165結(jié)合BMP2相對(duì)于單個(gè)基因?qū)?/p>

9、出現(xiàn)更有效的骨再生效應(yīng)，這個(gè)推測(cè)值得信任嗎？這將涉及到VEGF165結(jié)合BMP2雙基因共轉(zhuǎn)染干細(xì)胞遠(yuǎn)期是否能運(yùn)用于骨缺損修復(fù)，因此，評(píng)估VEGF165結(jié)合BMP2基因在骨再生過(guò)程中的作用具有重要意義。
　　 目的：
　　 1、通過(guò)慢病毒載體介導(dǎo)VEGF165和BMP2基因共感染大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，掌握慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，以便應(yīng)用于以后其他研究。
　　 2、探討體外VEGF165和BMP2基因共感染大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞在

10、骨再生過(guò)程中的作用。
　　 材料和方法
　　 1、采用分子生物學(xué)的方法設(shè)計(jì)、合成引物，使用PCR的方法擴(kuò)增VEGF165和BMP2基因，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建BMP2慢病毒表達(dá)載體和BMP2/VEGF165雙基因慢病毒表達(dá)載體，限制性核酸內(nèi)切酶酶切鑒定篩選陽(yáng)性克隆，菌落PCR鑒定篩選慢病毒表達(dá)載體，測(cè)序并與Genebank比較。
　　 2、在脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)下將構(gòu)建成功BMP2和BMP2

11、/VEGF165慢病毒表達(dá)載體分別與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞系(293T)包裝生產(chǎn)慢病毒，測(cè)定病毒滴度。
　　 3、復(fù)蘇P3的SD MSC（購(gòu)自賽業(yè)生物公司），經(jīng)過(guò)一次傳代后，待細(xì)胞狀態(tài)較好時(shí)可用于轉(zhuǎn)染，即使用P5的SD MSC進(jìn)行轉(zhuǎn)染。慢病毒1（攜帶BMP2、VEGF165、EGFP和neo）和慢病毒2(攜帶BMP2、EGFP和neo)分別轉(zhuǎn)染SD MSC，轉(zhuǎn)導(dǎo)48小時(shí)后于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)導(dǎo)效果，待兩株細(xì)胞長(zhǎng)至80％融合度時(shí)

12、，用0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml三個(gè)濃度的G418進(jìn)行轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的純化篩選。
　　 4、運(yùn)用Trizol方法進(jìn)行SD MSC/BMP2-VEGF165-EGFP和SD MSC/BMP2-EGFP兩種細(xì)胞RNA抽提，進(jìn)行cDNA鏈的合成。設(shè)計(jì)VEGF165、BMP2和GAPDH的引物序列去探測(cè)mRNA的表達(dá)，轉(zhuǎn)導(dǎo)后第5天的SDMSC/BMP2-VEGF165-EGFP和SD MSC/BMP2-EGFP兩種細(xì)

13、胞作為實(shí)驗(yàn)組，非轉(zhuǎn)導(dǎo)組作為對(duì)照組，Q-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞BMP2、VEGF165 mRNA表達(dá)。
　　 5、SD MSC/BMP2-VEGF165-EGFP和SD MSC/BMP2-EGFP兩種細(xì)胞感染后孵化48小時(shí)，感染組作為實(shí)驗(yàn)組，非感染組作為對(duì)照組，三組細(xì)胞分離出來(lái)的蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移到PVDF轉(zhuǎn)移膜以及膜的封閉，將適當(dāng)濃度的BMP2和VEGF165一抗和二抗加入到PVDF膜上，將ECL液滴加于PVDF膜表面，置于Fiuorc

14、hem HD2凝膠成像分析系統(tǒng)中，觀察、拍照。
　　 6、SD MSC/BMP2-VEGF165-EGFP和SD MSC/BMP2-EGFP兩種細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，非感染組作為對(duì)照組，每組的細(xì)胞進(jìn)行了3d、7d和14d成骨分化分析。細(xì)胞堿性磷酸酶活性檢測(cè)是由堿性磷酸酶(ALP)測(cè)定試劑盒完成。另一方面，三組細(xì)胞在成骨分化誘導(dǎo)14天后進(jìn)行茜素紅染色和堿性磷酸酶染色，倒置顯微鏡拍照;
　　 結(jié)果
　　 1、成功了構(gòu)建BM

15、P2慢病毒表達(dá)載體和BMP2/VEGF165雙基因慢病毒表達(dá)載體，菌落PCR鑒定及測(cè)序與Genebank比較，證明構(gòu)建的慢病毒表達(dá)載體正確。
　　 2、BMP2和BMP2/VEGF165慢病毒表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞系(293T)后熒光激發(fā)可見(jiàn)大量綠色熒光，收集、濃縮病毒后測(cè)定其滴度分別為7.45×107TU/ml和6.45×107TU/ml。
　　 3、慢病毒1（攜帶BMP2、VEGF165、EGFP和neo）和慢病

16、毒2（攜帶BMP2、EGFP和neo）分別轉(zhuǎn)染SD MSC，轉(zhuǎn)導(dǎo)48小時(shí)后于熒光顯微鏡下觀察， SDMSC/BMP2-EGFP轉(zhuǎn)染率約為85％，SD MSC/BMP2-VEGF165-EGFP轉(zhuǎn)染率約為80％，且熒光強(qiáng)。
　　 4、對(duì)照組沒(méi)觀察到BMP2和VEGF165基因的mRNA表達(dá)，在SD MSC/BMP2組未測(cè)量到VEGF165mRNA表達(dá)，在SD MSC/BMP2+VEGF組可以測(cè)量到VEGF165mRNA表達(dá);SD

17、MSC/BMP2和SD MSC/BMP2+VEGF兩種細(xì)胞都可以測(cè)量到BMP2基因的mRNA表達(dá)，兩組BMP2的表達(dá)沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05).
　　 5、免疫印跡分析表明，感染Lv-BMP2-VEGF165和Lv-BMP2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌大量的BMP2，那些非轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMP2分泌量極低。另一方面，所有的細(xì)胞，包括轉(zhuǎn)染和或非轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞均分泌大量的VEGF165。
　　 6、成骨分化誘導(dǎo)第

18、14天，三組細(xì)胞中陽(yáng)性染色面積最大的是BMP2組，BMP2+VEGF165組的陽(yáng)性染色面積大于對(duì)照組，但小于BMP2組，對(duì)照組堿性磷酸酶和茜素紅染色均為陰性。在三組細(xì)胞中，誘導(dǎo)分化后第14天的堿性磷酸酶活性跟第3天和7天差別有顯著性差別(P＜0.01);在誘導(dǎo)分化后第3、7、14天BMP2組ALP活性均顯著高于BMP2+VEGF165組(P＜0.01)。
　　 結(jié)論
　　 1、VEGF165表達(dá)抑制BMP2轉(zhuǎn)染的骨髓間質(zhì)