1、我國是世界上老年人口最多的國家,在所有的人群中約有9000萬人患有不同程度的骨質(zhì)疏松,因而骨質(zhì)疏松的治療和預(yù)防是極為重要的醫(yī)學(xué)課題。在骨衰老的進程中,破骨細胞對骨的吸收速率超過了成骨細胞的骨形成的速率,成骨細胞與破骨細胞之間的骨代謝平衡被打破是骨量下降,骨密度降低的重要因素。而骨髓間充質(zhì)干細胞作為成骨細胞的前體細胞,隨著衰老進程的加劇,其增殖、分化等能力的出現(xiàn)下降的趨勢。而這也直接導(dǎo)致了骨生成的減少,這是骨質(zhì)疏松發(fā)生的一個非常關(guān)鍵的因素

2、。而由于干細胞和骨質(zhì)疏松等增齡性骨疾病之間的密切聯(lián)系使得對干細胞的相關(guān)調(diào)控研究在本領(lǐng)域具有廣闊的前景。
　　小分子化合物作為近些年的研究熱點,被廣泛地應(yīng)用于對細胞的調(diào)控與干預(yù)的研究中。本課題的研究以新發(fā)現(xiàn)的小分子化合物庫為基礎(chǔ),從中篩選出了對骨髓間充質(zhì)干細胞命運調(diào)控具有明顯影響的小分子化合物,并對其影響的機制進行了進一步深入的探索,同時在動物模型上對其應(yīng)用效果進行驗證,篩選出了具有明顯抑制BMSCs衰老進程的相關(guān)小分子化合物。

3、r>　　1.研究思路
　　在實驗研究開始階段,我們通過對國家小分子化合物資源中心所提供的24個化合物庫中的約14000種小分子化合物進行初步的篩選。首先根據(jù)國家小分子化合物資源中心提供的對相關(guān)小分子化合物的作用方向的初步描述縮小了篩選范圍,通過對相關(guān)化合物研究進展的查閱以及其相關(guān)作用靶點的分析,最終選定了目前在干細胞治療領(lǐng)域尚未進行過相關(guān)研究,同時具有潛在的干細胞干預(yù)能力的小分子化合物共計27種,并應(yīng)用于接下來的化合物篩選的實驗研

4、究當(dāng)中。
　　在第一部分實驗中,首先對SD大鼠的BMSCs進行取材,以獲得用于化合物干預(yù)實驗的衰老的骨髓間充質(zhì)干細胞(aging-BMSCs),隨后使用選定的27種小分子化合物以梯度濃度(1000μM、100μM、10μM、1μM)分別對細胞進行干預(yù)。隨后通過使用實時定量PCR(RT-PCR)的方法對選定的27種小分子化合物作用于骨髓間充質(zhì)干細胞的相關(guān)靶點進行了mRNA水平的檢測。此處選用了與干細胞衰老進程密切相關(guān)的靶點β–gal

5、、p53、p21、p16、Nanog、Oct-4、TERT作為篩選靶點進行定量的檢測。在這一步中,我們通過對相關(guān)基因表達的定量分析初步獲得了11種對篩選靶點作用效果明顯的小分子化合物及其最佳作用的濃度。隨后我們通過對這11種選出的小分子化合物在同一批樣本中進行了橫向的對比,對其作用的效果進行了排序,并最終選定了5種小分子化合物用于進一步的研究中(apocynin、baxchannelblocker、iso-Olomoucine、(±)b

6、ayk8644、H-9)。
　　在第二部分實驗中,我們對選定的5種小分子化合物以最佳作用濃度對aging-BMSCs進行干預(yù),并對細胞進行了與衰老相關(guān)的多靶點的檢測。通過MTT細胞增殖實驗,我們對細胞的增殖能力進行了檢測;通過細胞SA-β–gal活性染色實驗。對細胞β–半乳糖苷酶活性及衰老狀態(tài)進行檢測;通過RT-PCR實驗以及WesternBlot實驗在mRNA水平和蛋白水平分別檢測細胞衰老和分化方面的改變;通過ALP染色、茜素紅

7、(AlizarinRed)染色、ALP活性定量檢測來觀察在對細胞進行成骨誘導(dǎo)后,細胞在分化水平的改變;通過流式技術(shù)(FlowCytomery)檢測來對細胞周期、細胞凋亡進行相關(guān)的檢測。在本部分的實驗中,我們發(fā)現(xiàn)選定的5種小分子化合物均具有明顯逆轉(zhuǎn)或延緩衰老骨髓間充質(zhì)干細胞衰老進程的作用。
　　在第三部分實驗中,我們對小分子化合物Apocynin抗衰老的作用進行了更加細致的研究。首先我們在體外實驗中對apocynin作用于aging

8、-BMSCs的分子機制進行了探索。通過對NADPHOxidase活性的定量檢測、細胞內(nèi)活性氧(ROS)水平定量檢測及定性檢測等實驗我們發(fā)現(xiàn)了apocynin在衰老骨髓間充質(zhì)干細胞中改變衰老進程的相關(guān)分子信號通路及其作用的方式。同時,我們通過使用SAMP6早衰小鼠模型對apocynin的作用進行了進一步的體內(nèi)檢測。我們發(fā)現(xiàn)apocynin的作用明顯改善了p6小鼠的骨質(zhì)疏松及骨衰老的進程。通過Micro-CT檢測apocynin干預(yù)下其骨密

9、度、骨量的改變;通過TRAP-ALP組織切片染色來檢測apocynin對骨組織中成骨-破骨細胞平衡的改變情況。同時對SAMP6小鼠的BMSCs進行取材,通過相關(guān)體外實驗檢測其在衰老與分化方面的改變情況。
　　2.實驗結(jié)果
　　第一部分小分子化合物的篩選
　　1)通過對國家小分子化合物資源中心提供的化合物庫進行初步的梳理分析,我們從中心提供的24個化合物庫中選定了8個列出小分子化合物初步作用靶點或方向的化合物庫進行篩選,

10、從這8個庫中對其列出的每個小分子化合物采用一定的篩選標(biāo)準(zhǔn)進行篩選。
　　2)根據(jù)所列出的小分子化合物的初步作用靶點,我們選出了與干細胞治療或調(diào)節(jié)干細胞命運密切相關(guān)的小分子化合物共計27種并訂購,開展下一部分的研究。
　　3)通過對雄性22月大的SD大鼠進行BMSCs的取材,并對所獲得的細胞進行衰老鑒定,確認了用于篩選的細胞模型符合預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)。
　　4)將27種小分子化合物稀釋成不同的濃度梯度(1000μM、100μM、1

11、0μM、1μM)分別對細胞進行干預(yù),并對干預(yù)后的細胞進行總mRNA的收集用于RT-PCR的檢測。通過對靶點β–gal、p53、p21、p16、Nanog、Oct-4、TERT的檢測來判斷其對細胞衰老進程的影響程度。據(jù)此我們選出了11中具有明顯作用的小分子化合物及其作用于細胞的最佳濃度。
　　5)接下來在同一批細胞樣本中對選定的11種小分子化合物進行了橫向的比對,使用RT-PCR檢測其作用效果,并對其影響結(jié)果進行了定量的排序。從中選

12、出了作用效果最好的5種小分子化合物(apocynin、baxchannelblocker、iso-Olomoucine、(±)bayk8644、H-9)進行后續(xù)的實驗研究。
　　第二部分小分子化合物對Aging-BMSCs的細胞行為學(xué)的影響
　　1)在對細胞衰老進程相關(guān)指標(biāo)的檢測中,我們發(fā)現(xiàn)apocynin、baxchannelblocker、iso-Olomoucine、(±)bayk8644、H-9均在不同程度上對細胞的

13、衰老進程產(chǎn)生了影響。
　　2)我們對衰老的骨髓間充質(zhì)干細胞進行了成骨分化誘導(dǎo),并使用選定小分子化合物干預(yù)其分化的過程。在對細胞分化相關(guān)指標(biāo)的檢測中,我們發(fā)現(xiàn)apocynin、baxchannelblocker、iso-Olomoucine、(±)bayk8644在分化的不同階段中,均促進了aging-BMSCs的骨向分化能力。
　　第三部分Apocynin的作用分子機制及其體內(nèi)應(yīng)用效果的研究
　　1)本部分我們對apo

14、cynin在aging-BMSCs中的分子機制及作用通路進行了探索研究。在NADPH氧化酶的定量檢測中,我們發(fā)現(xiàn)apocynin能夠明顯抑制NOX的活性;在細胞內(nèi)活性氧的檢測中,我們發(fā)現(xiàn)apocynin的干預(yù)降低了細胞內(nèi)ROS的水平,同時我們還對p53隨細胞內(nèi)ROS的水平變化的表達在mRNA水平和蛋白水平進行了檢測,發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)ROS水平的改變與p53的表達成正相關(guān)。
　　2)接下來我們選用了SAMP6小鼠模型使用apocynin進

15、行了體內(nèi)的干預(yù)。小鼠自3個月大時開始接受小分子化合物的腹腔注射,在注射3個月后進行取材分析。Micro-CT結(jié)果顯示apocynin明顯改善了骨密度及骨小梁含量;Trap-Alp組織切片染色顯示apocynin干預(yù)后,成骨細胞明顯增多,而破骨細胞水平?jīng)]有影響。
　　3)對SAMP6小鼠的BMSCs取材進行分析,SA-β–gal染色顯示隨著細胞傳代數(shù)的增加,apocynin干預(yù)組的細胞衰老速度要低于DMSO對照組;RT-PCR結(jié)果顯

16、示,與DMSO組相比,apocynin組的p53表達減少,Oct-4表達增加;細胞增殖能力的實驗結(jié)果同時表明,apocynin干預(yù)組的細胞具有更強的增殖能力;進行分化誘導(dǎo)后的ALP活性定量檢測結(jié)果顯示實驗組具有更高的ALP活性。
　　3.結(jié)論
　　1)Apocynin、baxchannelblocker、iso-Olomoucine、(±)bayk8644四種小分子化合物對骨衰老過程中骨髓間充質(zhì)干細胞的衰老進程有著明顯的延緩

17、或逆轉(zhuǎn)作用。四種小分子化合物均能夠在細胞水平改善衰老相關(guān)基因的表達,細胞的增殖、骨向分化等方面均產(chǎn)生了相關(guān)的改善現(xiàn)象。對這四種小分子化合物的進一步探索對研究干細胞治療骨質(zhì)疏松等骨衰老疾病具有重要的意義與廣泛的研究前景。
　　2)Apocynin能夠通過下調(diào)NOX的表達來改變細胞內(nèi)活性氧的水平,從而直接影響到p53的表達,從而激活p53下游的一系列分子應(yīng)答機制,改善細胞的衰老狀態(tài),增加了細胞的增殖能力和分化潛能。使用apocynin