1、不孕不育癥是嚴重影響人類生殖健康的世界性問題，在我國的發(fā)病率約為7％-10％，隨著人類輔助生殖技術(assistedreproductivetechnology，ART)的快速發(fā)展，體外受精-胚胎移植(Invitrofertilization-embryotransfer，IVF-ET)技術在卵泡的募集和卵母細胞的獲取上已經有90％以上的成功機會，胚胎質量明顯優(yōu)化，獲取優(yōu)質胚胎的數量亦明顯增多，但是其臨床妊娠率卻一直未能盡如人意，且多胎

2、妊娠發(fā)生率和流產率較高，如何更好的提高IVF-ET過程卵細胞的數量及質量成為眾多學者關注的焦點。近年來，中醫(yī)藥在提高卵母細胞質量、誘導排卵、提高妊娠率及降低西藥的毒副作用等方面取得了長足的發(fā)展。本課題組前期研究了補腎法、疏肝法對無排卵模型大鼠生殖功能的影響，證實補腎法、疏肝法可以通過改善腺垂體、卵巢形態(tài)，調節(jié)下丘腦神經遞質水平以及生殖內分泌激素水平，促進卵泡發(fā)育和成熟，并可促進子宮發(fā)育，調節(jié)子宮內膜環(huán)境以有利于孕卵著床;研究了補腎調經方

3、、逍遙散對IVF-ET妊娠結局及OSFs的影響，證實加用補腎調經方、逍遙散可以增加獲卵數，提高優(yōu)質胚胎率及臨床妊娠率。本課題擬在前期研究的基礎上，進一步通過動物實驗研究補腎法、疏肝法對卵母細胞發(fā)育的影響，為在臨床上聯(lián)合IVF-ET治療不孕癥奠定理論基礎。
　　 卵母細胞的數量及質量直接影響到IVF-ET的結局，近些年對生殖生理及生殖內分泌的研究發(fā)現，卵泡發(fā)育除了受下丘腦、垂體分泌的相關激素水平調控外，卵母細胞分泌因子(Oocyt

4、esecretedfactors，OSFs)在調節(jié)卵泡的發(fā)育和衰退，影響優(yōu)勢卵泡的選擇以及閉鎖卵泡的形成方面發(fā)揮重要作用，其中，卵母細胞分泌的轉化生長因子(transforminggrowthfactor-β，TGF-β)超家族成員GDF-9與BMP-6通過與Ⅱ型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體結合，與Ⅰ型受體共同作用啟動信號轉導[1]，而Smads是TGF-β超家族下游信號轉導分子，在其信號轉導過程中發(fā)揮重要的作用。GDF-9和BMP-6及其S

5、mads信號途徑對體內卵泡發(fā)生發(fā)育、卵丘擴散、卵母細胞的成熟至關重要[2-3]。由于在臨床上收集人卵母細胞用于實驗研究的局限性，本課題擬在前期研究的基礎上，以小鼠卵母細胞OSFs及其Smads通路為切入點研究補腎法、疏肝法對小鼠卵母細胞質量的影響與調控OSFs及其Smads通路關系，探討補腎法、疏肝法提高卵母細胞質量、改善妊娠結局的機制和作用環(huán)節(jié)，為中醫(yī)藥輔助IVF-ET治療不孕癥提供實驗依據。
　　 第一部分補腎法、疏肝法對小

6、鼠卵母細胞質量及妊娠結局的影響
　　 目的:觀察補腎調經方、逍遙丸對小鼠卵母細胞數量、優(yōu)質卵泡數、妊娠率、子宮胚胎數及相關激素水平的影響，以探討補腎法、疏肝法對小鼠卵母細胞質量及妊娠結局的影響。
　　 方法:選用6-7周齡健康雌性昆明小鼠210只，8-9周齡有生育能力雄性小鼠120只，將雌性小鼠按隨機數字表法完全隨機分為6組，即補腎高劑量組、補腎低劑量組、疏肝高劑量組、疏肝低劑量組、控制性超排卵組（COH組）和空白對照組

7、，每組35只。補腎高、低劑量組分別給予補腎調經方口服液5.4g/ml、2.7g/ml，疏肝高、低劑量組分別給予逍遙丸混懸液0.6g/ml、0.3g/ml，COH組和空白對照組用蒸餾水灌胃。每日8:00各組小鼠均以1ml/100g體重灌胃，連續(xù)10天。治療組及COH組于第11日同時腹腔注射PMSG10IU/只，48h后腹腔注射HCG10IU，空白對照組每日陰道涂片，觀察動情周期。注射HCG同時，補腎高低劑量組、疏肝高低劑量組和COH組各取

8、20只;空白對照組陰道涂片見到大量角化上皮細胞時取20只，按雌∶雄=1∶1比例分別合籠飼養(yǎng)，次日早晨7:00-8:00檢查雌鼠陰道，發(fā)現陰栓者記為妊娠第1天（陰栓為小鼠陰道分泌物與精液凝結而成），于妊娠第18-20天解剖雌鼠，觀察妊娠鼠數及子宮胚胎數。空白對照組剩余15只小鼠于陰道涂片見到大量角化上皮細胞的次日、其余各組剩余小鼠于注射HCG16h后，用摘除眼球法取血，留取血清后測定FSH、LH、E2的含量;然后脫頸椎處死小鼠，留取卵母細

9、胞，計數卵泡數量及優(yōu)質卵泡數。
　　 結果:(1)各組小鼠獲卵數及優(yōu)質卵泡數比較:與空白對照組比較，COH組及各治療組獲卵數增加(P＜0.05)，各治療組與COH組比較均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），各治療組之間獲卵數比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);各治療組優(yōu)質卵泡數高于空白對照組及COH組(P＜0.05)，COH組低于空白對照組(P＜0.05);高劑量組優(yōu)質卵泡數均優(yōu)于低劑量組(P＜0.05)，補腎高劑量組與疏肝高劑量組的優(yōu)

10、質卵泡數比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，補腎低劑量組與疏肝低劑量組比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。(2)各組小鼠妊娠率及子宮胚胎數比較:COH組小鼠妊娠率較空白對照組降低(P＜0.05)，補腎高劑量組和疏肝高劑量組妊娠率較空白對照組及COH組升高(P＜0.05)，低劑量組與空白對照組比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);高劑量組小鼠妊娠率均優(yōu)于低劑量組(P＜0.05)，高劑量組間比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，低劑量組間比較無統(tǒng)計學意

11、義(P＞0.05);各組之間子宮胚胎數比較均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。(3)各組小鼠血清FSH、LH、E2值比較:與空白對照組比較，各治療組及COH組血清FSH、LH、E2水平增高(P＜0.05);與COH組比較，各治療組血清FSH、LH、E2水平增高（P＜0.05），其中高劑量組的表達優(yōu)于低劑量組(P＜0.05)，補腎高劑量組與疏肝高劑量組之間無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，補腎低劑量組與疏肝低劑量組之間無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)

12、。
　　 結論:在用促性腺激素處理小鼠的同時加用補腎調經方和逍遙丸不會降低獲卵數，并能增加優(yōu)質卵母細胞數量，提高妊娠率及總胚胎數。
　　 第二部分:補腎法、疏肝法對小鼠卵母細胞GDF-9及Smads通路影響的比較
　　 目的:通過研究補腎法、疏肝法對小鼠卵母細胞中卵母細胞分泌因子GDF-9、相關受體BMPRⅡ、ALK-5及下游Smads通路中Smad2、Smad3的影響，探討兩法對卵母細胞質量影響的靶向性機制。<

13、br>　　 方法:選用6-7周齡健康雌性昆明小鼠600只，按隨機數字表法完全隨機化分為6組，即補腎高劑量組、補腎低劑量組、疏肝高劑量組、疏肝低劑量組、COH組和空白對照組，每組100只。補腎高、低劑量組分別給予補腎調經方口服液，疏肝高、低劑量組分別給予逍遙丸混懸液，COH組和空白對照組用蒸餾水灌胃。每日8:00各組小鼠均以1ml/100g體重灌胃，連續(xù)10天。補腎高劑量組、補腎低劑量組、疏肝高劑量組、疏肝低劑量組及COH組于第11日同

14、時腹腔注射PMSG10IU/只，48h后腹腔注射HCG10IU/只;空白對照組每日陰道涂片，觀察動情周期。注射HCG16h后，取補腎高低劑量組、疏肝高低劑量組和COH組小鼠，以及空白對照組陰道涂片見到大量角化上皮細胞的次日小鼠，脫頸椎處死，在體視鏡下用1ml注射針劃破輸卵管壺腹部，收集卵丘卵母細胞復合體(COCs)，用透明質酸酶消化掉卵丘顆粒細胞后用PBS反復沖洗，獲得MⅡ期卵母細胞，采用免疫組化法、實時熒光定量PCR分別檢測卵母細胞中

15、GDF-9、ALK-5、BMPRⅡ、Smad2、Smad3蛋白及其mRNA表達;采用Westernblot方法檢測卵母細胞中GDF-9和BMPRⅡ蛋白的表達。
　　 結果:(1)與空白對照組比較，COH組GDF-9蛋白及mRNA的表達降低(P＜0.05)，各治療組的表達升高（P＜0.05）;高劑量組GDF-9蛋白及mRNA表達高于低劑量組(P＜0.05)，補腎高劑量組與疏肝高劑量組比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，補腎低劑量組與

16、疏肝低劑量組比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。(2)與空白對照組比較，COH組、補腎高劑量組、補腎低劑量組及疏肝低劑量組BMPRⅡ蛋白及mRNA表達無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);疏肝高劑量組BMPRⅡ蛋白和mRNA的表達較其余各組均增強，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。(3)ALK-5、Smad2、Smad3蛋白表達在各組間比較均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 結論:補腎調經方和逍遙丸均可以提高小鼠卵母細胞GDF-9蛋白及m

17、RNA的表達，從而改善卵泡發(fā)育，提高卵母細胞質量，但其機制與GDF-9Ⅰ型受體及下游Smads通路無關。
　　 第三部分:補腎法、疏肝法對小鼠卵母細胞BMP-6及Smads通路影響的比較
　　 目的:通過觀察補腎法、疏肝法對小鼠卵母細胞中卵母細胞分泌因子BMP-6、相關受體ALK-2、ALK-6及下游Smads通路中Smad1、Smad5、Smad8和Smad4的影響，探討兩法對卵母細胞質量的影響的靶向性機制。
　

18、　 方法:動物分組及取材同第二部分。免疫組化和Westernblot方法檢測卵母細胞BMP-6、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8、Smad4蛋白的表達，實時熒光定量PCR法檢測卵母細胞上述指標mRNA的表達。
　　 結果:(1)BMP-6:與空白對照組比較，COH組卵母細胞BMP-6蛋白和mRNA的表達無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，各治療組表達升高，并高于COH組(P＜0.05);疏肝高劑量組的表達高

19、于補腎低劑量組和疏肝低劑量組(P＜0.05)，低于補腎高劑量組(P＜0.05);補腎低劑量組與疏肝低劑量組之間比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。(2)ALK-2:與空白對照組比較，COH組ALK-2蛋白及mRNA表達無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);各治療組ALK-2的蛋白及mRNA表達均高于空白對照組和COH組(P＜0.05);組間比較顯示:各治療組高劑量組ALK-2蛋白及mRNA表達均高于低劑量組(P＜0.05);疏肝高劑量組表達較補腎

20、高劑量組降低(P＜0.05)，補腎低劑量組與疏肝低劑量組比較則無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。(3)ALK-6:與空白對照組比較，COH組ALK-6蛋白及mRNA表達無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);空白對照組和COH組與治療組比較，ALK-6蛋白及mRNA表達降低(P＜0.05);補腎組表達高于疏肝組(P＜0.05)，補腎低劑量組的ALK-6蛋白及mRNA表達較補腎高劑量組降低(P＜0.05)，疏肝高劑量組蛋白表達高于疏肝低劑量組(P＜0.

21、05)。(4)Smad1:空白對照組與COH組比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);各治療組Smad1蛋白及mRNA表達高于空白對照組和COH組(P＜0.05);與補腎高劑量組比較，其余三個治療組的表達降低(P＜0.05)，補腎低劑量組較疏肝組蛋白及基因表達增強(P＜0.05)，疏肝高劑量組Smad1蛋白及基因表達較疏肝低劑量組增強(P＜0.05)。(5)Smad5:與空白對照組比較，COH組表達無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，各治療組蛋白及

22、mRNA表達增加，并高于COH組(P＜0.05);高劑量組表達較低劑量組升高(P＜0.05)，補腎高劑量組的表達高于疏肝高劑量組(P＜0.05)，疏肝低劑量組較補腎低劑量組表達降低(P＜0.05)。(6)Smad8:空白對照組與COH組的Smad8蛋白及mRNA表達無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);各治療組Smad8蛋白及mRNA表達較空白對照組和COH組升高(P＜0.05);與高劑量組比較，各低劑量組的Smad8蛋白及mRNA表達均降低(

23、P＜0.05)，補腎高劑量組與疏肝高劑量組之間比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，補腎低劑量表達較疏肝低劑量組增強(P＜0.05)。(7)Smad4:與空白對照組比較，COH組蛋白及mRNA表達無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，各治療組表達增高，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);高劑量組Smad4蛋白及基因表達高于低劑量組（P＜0.05），補腎高劑量組表達高于疏肝高劑量組(P＜0.05)，補腎低劑量組與疏肝低劑量組比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)