1、研究目的：
　　 研究人原代晶狀體上皮細(xì)胞中PEDF基因表達(dá)與波形蛋白和αB-晶狀體蛋白的關(guān)系。
　　 材料和方法：
　　 眼組織來源：人尸體眼球來源于中山眼科中心眼庫。所有與尸體解剖相關(guān)性的研究均已通過中山大學(xué)人文倫理委員會(huì)的許可。我們所有的研究均遵照政府及相關(guān)公共組織的關(guān)于人類及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理道德條款。
　　 人晶狀體原代上皮細(xì)胞的培養(yǎng)：晶狀體上皮細(xì)胞貼敷于尸體眼的晶狀體前囊膜下。在解剖顯微鏡下，撕取晶

2、狀體的前囊膜，平鋪于培養(yǎng)皿底部，上皮細(xì)胞面向上。滴取一滴胎牛血清與上皮細(xì)胞面，保持細(xì)胞面的濕潤。放于37℃0.5％CO2的培養(yǎng)箱孵育2小時(shí)，使前囊膜充分貼敷于培養(yǎng)皿的底部。用含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
　　 采用GenScript's siRNA design center siRNA Target Finder和siRNA ConstructBuilder軟件設(shè)計(jì)三個(gè)shRNA序列，用于人PEDF基因

3、的RNA干擾。運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)將這些寡核苷酸序列克隆到質(zhì)粒載體SD1211上。然后通過Gateway技術(shù)將設(shè)計(jì)的寡核苷酸序列克隆到pLenti6/V5-D-TOPO質(zhì)粒載體中，用于慢病毒的產(chǎn)生。在用慢病毒感染細(xì)胞48小時(shí)后，用RNeasy plus Mini kit提取細(xì)胞中的總RNA。做三次重復(fù)的實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)。實(shí)驗(yàn)中我們采用家族管理基因GAPDH作為對(duì)照基因。用△△Ct得出不同組PEDF

4、基因RNA水平含量的差別。人原代晶狀體上皮細(xì)胞PEDF基因RNA干擾48小時(shí)后，Western Blot方法檢測其中波形蛋白以及αB-晶狀體球蛋白表達(dá)水平的變化。
　　 結(jié)果：
　　 人晶狀體原代上皮細(xì)胞的培養(yǎng)：
　　 帶有晶狀體上皮細(xì)胞的人晶狀體前囊膜完整的貼敷于培養(yǎng)皿上，24小時(shí)觀察到健康的晶狀體上皮細(xì)胞貼敷于前囊膜上，5天后晶狀體上皮細(xì)胞溢出囊膜范圍，遷移到培養(yǎng)皿上。10天后，培養(yǎng)皿上上皮細(xì)胞達(dá)到70％-8

5、0％的融合，并且呈現(xiàn)出正常的上皮源性細(xì)胞的形態(tài)特征。
　　 慢病毒感染人原代晶狀體上皮細(xì)胞：鑒于普通質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)在原代上皮細(xì)胞上的成功率比較低，所以我們構(gòu)建了慢病毒載體結(jié)構(gòu)來表達(dá)shRNA，以達(dá)到對(duì)PEDF基因下調(diào)的目的。同時(shí)我們在構(gòu)建的shRNA結(jié)構(gòu)中表達(dá)綠色熒光(GFP)片斷，以便于觀察感染的效率。在熒光顯微鏡下，對(duì)感染48小時(shí)后的細(xì)胞照相，我們發(fā)現(xiàn)每一組的感染率都在80％左右。
　　 shRNA作用下PEDF基因被

6、下調(diào)的效果鑒定
　　 表達(dá)相應(yīng)shRNA的慢病毒感染人晶狀體原代上皮細(xì)胞48小時(shí)后，收集細(xì)胞，提取RNA。用定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)檢測PEDF基因mRNA水平的表達(dá)變化。最終發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)任何慢病毒感染的對(duì)照組，以及表達(dá)非特異性隨機(jī)序列shRNA(scramble group)的慢病毒組PEDF的mRNA在大致相同的表達(dá)水平。其余的三種針對(duì)于PEDF基因進(jìn)行特異性RNA干擾的慢病毒組，其PEDF的RNA水平

7、與對(duì)照組以及scramble組比較均有顯著的下調(diào)(p＜0.01)。PEDF基因被干擾后波形蛋白以及αB-晶狀體球蛋白含量的變化
　　 用Western Blot的方法檢測對(duì)PEDF基因進(jìn)行RNA干擾48小時(shí)后波形蛋白以及αB-晶狀體球蛋白含量的變化。用GAPDH作為內(nèi)參基因。與未經(jīng)感染的對(duì)照組比較，αB-晶狀體球蛋白的表達(dá)量在shRNA-scramble組中增加～30％，在shRNA-1試驗(yàn)組明顯增加～219％，在shRNA-2

8、試驗(yàn)組增加～204％，在shRNA-3試驗(yàn)組增加～93％.波形蛋白的表達(dá)量在shRNA-scramble試驗(yàn)組組中降低約～13％在shRNA-1試驗(yàn)組中明顯降低約～72％，shRNA-2試驗(yàn)組中降低～79％，在shRNA-3試驗(yàn)組中降低～93％.這項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果顯示在特異性針對(duì)PEDF基因進(jìn)行RNA干擾的試驗(yàn)組(shRNA2，shRNA3和shRNA4)，波形蛋白的表達(dá)量明顯降低，而αB-晶狀體球蛋白的表達(dá)量卻顯著升高(P＜0.05).(O