1、研究背景和研究目的： 惡性淋巴瘤是淋巴結(jié)或淋巴結(jié)外部分淋巴組織的免疫細胞腫瘤，一般分為霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’s Lymphoma）和非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’s Lymphoma，NHL）兩大類。我國霍奇金淋巴瘤的發(fā)病率總體較低，菲霍奇金淋巴瘤是最常見的淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，在我國近年來非霍奇金淋巴瘤的發(fā)病率呈上升趨勢，在過去20年，它的發(fā)病率增加了75％，在發(fā)病率增長最快的腫瘤中位居第3位

2、。因此NHL的防治工作一直是我國醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域的重點，尋找安全有效的藥物是腫瘤治療中的重要課題。近年來動物來源藥物越來越受重視，充分利用我國動物資源開發(fā)新的抗腫瘤藥物，成為腫瘤研究領(lǐng)域的重要內(nèi)容。 蝎毒作為中醫(yī)傳統(tǒng)藥材已經(jīng)應(yīng)用幾千年了。在中國第一部藥典《本草綱目》中，全蝎被用于治療多種疾病。蝎毒為傳統(tǒng)藥材全蝎的主要活性物質(zhì)，存在于蝎尾部毒囊內(nèi)，鰲刺時由鰲針排出?，F(xiàn)代藥理學研究表明，蝎毒主要由蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)兩部分組成，蝎毒的主要活

3、性成分是蛋白質(zhì)。蝎毒具有廣泛的藥理學性質(zhì)，近年來國外對蝎毒的研究主要集中在膜通道阻滯的作用和抗毒素方面，罕見關(guān)于蝎毒抗腫瘤方面的研究報道，國內(nèi)的研究側(cè)重其抗腫瘤、抗風濕、抗癲癇、抗炎、纖溶、鎮(zhèn)痛以及對心血管病的作用等方面；國內(nèi)學者對蝎毒的抗腫瘤作用進行了較多研究，從蝎及蝎毒的抗腫瘤作用、蝎毒的成分和主要成分的藥理作用、全蝎及蝎毒抗腫瘤的臨床應(yīng)用等方面分析，結(jié)果與結(jié)論顯示，蝎毒可抑制多種人類腫瘤細胞生長，誘導腫瘤細胞凋亡。但是，蝎毒素對腫

4、瘤細胞殺傷或生長抑制具有一定的腫瘤差異性，有一定的腫瘤譜；而且有關(guān)蝎毒抗腫瘤作用與靶細胞基因表達的關(guān)聯(lián)問題目前未見文獻報道，其誘導細胞凋亡的具體分子機制至今尚未完全闡明，這是一個值得探討的領(lǐng)域。 腫瘤的發(fā)生通常被認為是由于細胞原癌基因的激活和抑癌基因的失活，擾亂了正常的增殖、分化和凋亡的調(diào)控，導致細胞增殖過度而凋亡不足。PTEN（第10號染色體缺失性磷酸酶--張力蛋白同源性基因）基因是一種新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因。它的蛋白產(chǎn)物具有脂

5、磷酸酶活性，其主要作用底物是磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）。PIP3是PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路的關(guān)鍵性組分，負責刺激正常細胞生長以及抑制腫瘤細胞的生長。PTEN使PIP3形成PIP2，降低PIP3水平，抑制了Akt的活性，因此降低了Bad磷酸化，導致細胞的凋亡；促進了p27的表達，引起細胞周期停滯。已發(fā)現(xiàn)這種基因在淋巴瘤細胞中5％可發(fā)生突變，導致對腫瘤的生長失去抑制作用。 非霍奇金淋巴瘤（NHL）作為我國最常見淋

6、巴系統(tǒng)的惡性腫瘤，近年來雖然放療、化療及造血干細胞移植的有了極大發(fā)展，淋巴瘤的死亡率并沒有降低。人們致力于尋找新的、療效肯定、毒副作用小的化療藥物，尤其是作用于腫瘤發(fā)生環(huán)節(jié)的藥物。為了探討蝎毒在NHL，淋巴瘤治療中的應(yīng)用價值，我們研究了蝎毒對NHL，淋巴瘤細胞株Raji和Jurkat細胞及正常人外周血淋巴細胞增殖、細胞周期和凋亡的影響。通過采用分子生物學技術(shù)檢測凋亡相關(guān)蛋白PTEN、Akt、p-Akt、Bad、p-Bad、p27和PTE

7、N mRNA的改變，以進一步闡明蝎毒的抗腫瘤作用的分子機制。 研究內(nèi)容： 1、蝎毒素誘導NHL細胞株Raji和Jurkat細胞凋亡的作用； 2、蝎毒素對Raji和Jurkat細胞周期分布的影響； 3、蝎毒素誘導Raji和Jurkat細胞凋亡的重要分子及信號通路； 4、蝎毒素對Raji和Jurkat細胞周期相關(guān)蛋白的影響。 研究方法： 1.甲基四唑藍（MTT）法檢測不同濃度、不同時間

8、點蝎毒素（BmK）對NHL細胞株及人正常外周血淋巴細胞的抑制作用 選用NHL細胞株Raji和Jurkat及人正常外周血淋巴細胞為研究對象，采用臺盼藍染色，細胞計數(shù)儀計數(shù)， MTT法檢測細胞存活率，由此確定各組的的IC50值。 2.細胞凋亡檢測方法如下 2.1倒置相差顯微鏡觀察藥物作用后細胞形態(tài)學變化； 2.2 Hoechst3342熒光染色并利用熒光顯微鏡，觀察細胞核形態(tài)學變化； 2.3 Anne

9、xin V-FITC和PI染色，流式細胞儀（FCM）檢測細胞凋亡情況，計算細胞凋亡率； 2.4 LY294002聯(lián)合蝎毒素對細胞凋亡的影響 在蝎毒素作用細胞前20分鐘加入終濃度對20μM的LY294002，然后蝎毒素處理細胞48 h，F(xiàn)CM檢測細胞凋亡率。 3.PI染色流式細胞儀（FCM）檢測細胞周期分布情況。 4.Western blot進一步檢測蝎毒素處理前后細胞周期、細胞凋亡及信號轉(zhuǎn)導途徑的相關(guān)蛋白

10、PTEN、Akt、p-Akt、Bad、p-Bad、p27蛋白水平變化。 5.半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（PT-PCR）檢測PTEN mRNA的表達。 6.統(tǒng)計學處理：本實驗所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表達，實驗組與對照組比較用t檢驗，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。 研究結(jié)果： 1.臺盼藍染色，細胞計數(shù)儀計數(shù)和MTT法均顯示：蝎毒素對NHL細胞株Raji和Jurkat細胞具有生長的抑制作用，呈濃度、時間相關(guān)性。蝎

11、毒素對NHL細胞株和人外周血淋巴細胞（PBLs）作用48后，IC50分別為275.40μg/ml（Raji）、360.60μg/ml（Jurkat）和1110μg/mL（PBLs），各組間經(jīng)統(tǒng)計學處理有顯著性差異（p<0.05）。以上結(jié)果提示：蝎毒素對NHL細胞株Raji和Jurkat細胞的增殖抑制作用強于人外周血淋巴細胞（PBLs），低濃度（≤500μg/ml）時對PBLs細胞的生長抑制作用不明顯。兩種NHL細胞株中，Raji細胞對蝎

12、毒素較敏感，強于Jurkat細胞。 2.蝎毒對淋巴瘤細胞凋亡的影響： 2.1倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)：蝎毒處理Raji和Jurkat細胞48 h后，細胞大小不一，呈現(xiàn)細胞碎片及胞漿內(nèi)顆粒增多等特征，并最終死亡。 2.2 Hoechst3342染色熒光顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，蝎毒素處理組中Raji和Jurkat細胞核均呈現(xiàn)碎塊狀致密濃染，熒光染色增強；隨著濃度增高，凋亡小體產(chǎn)生，符合凋亡的形態(tài)學改變。

13、2.3 Annexin V-FITC/PI染色FCM檢測顯示：蝎毒素能夠誘導Raji和Jurkat細胞株凋亡，其凋亡率隨用藥劑量增加而增加，并且Raji細胞的早期凋亡率（43±7％）明顯高于Jurkat細胞（24±5％），有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。蝎毒素作用PBLs細胞48小時后，各濃度組凋亡率較空白對照組的差異未顯示統(tǒng)計學意義（P>0.05）。以上結(jié)果提示：蝎毒素可選擇性作用于NHL細胞株誘導其凋亡，而對人正常外周血淋巴細胞影響較

14、小。 3.PI染色流式細胞儀（FCM）檢測發(fā)現(xiàn)：蝎毒素引起NHL細胞株Raji和Jurkat細胞G0/G1期阻滯。 4.Western blot檢測發(fā)現(xiàn)：蝎毒素促使Raji細胞PTEN蛋白表達增加，同時p-Akt、p-Bad蛋白表達減少；而對Jurkat細胞以上蛋白表達無影響。提示蝎毒素誘導PTEN蛋白表達上調(diào)，且該PTEN蛋白為功能性蛋白，可以下調(diào)Akt、Bad磷酸化水平，從而影響PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路，這可能是

15、蝎毒素誘導Raji細胞凋亡的重要機制。 5.為了進一步驗證PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路在蝎毒素誘導Raji細胞凋亡中的作用，LY294002（PI3K特異抑制劑）聯(lián)合蝎毒素對Raji細胞的影響。發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥呈現(xiàn)疊加效應(yīng)，不僅使Raji細胞凋亡率明顯增加，同時使Akt磷酸化水平進一步降低。由此我們判斷，蝎毒素通過上調(diào)PTEN表達水平，激活PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路是蝎毒素誘導Raji細胞凋亡的重要機制之一。 6.RT-P

16、CR法測PTEN mRNA的表達水平，Raji細胞中發(fā)現(xiàn)PTEN mRNA表達呈蝎毒素濃度依賴性增加，說明蝎毒素是在PTEN基因轉(zhuǎn)錄水平影響PTEN蛋白表達。 7.Western blot檢測發(fā)現(xiàn)：蝎毒素作用Raji和Jurkat細胞48 h后，伴隨著G1期阻滯，p27蛋白表達呈蝎毒素濃度依賴性增加。提示蝎毒素促使Raji和Jurkat細胞凋亡的機制還與上調(diào)p27蛋白進而導致G1期細胞阻滯有關(guān)。 結(jié)論： 蝎毒素能

17、夠抑制NHL細胞株Raji和Jurkat細胞的增殖，并且呈時間、濃度依賴性?？梢哉T導Raji和Jurkat細胞凋亡和細胞周期G1期阻滯的能力?？赡苁峭ㄟ^以下的機制發(fā)揮作用的：1、在PTEN基因轉(zhuǎn)錄水平促進Raji細胞PTEN蛋白表達，抑制Akt、Bad的磷酸化，從而激活P13K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路，這可能是蝎毒素誘導Raji細胞凋亡的重要機制之一。2、還可以通過菲PTEN依賴途徑，上調(diào)p27蛋白的表達，引起G1期細胞周期停滯，這是蝎毒誘