1、目的:間質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類分布廣泛且具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，能遷移到炎癥和損傷組織部位。幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, H.pylori)是慢性活動(dòng)性胃炎和消化性潰瘍的重要病因，與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)，H.pylori感染的胃腸道上皮細(xì)胞能促進(jìn)MSCs向胃腸粘膜層募集。因此，MSCs是H.pylori感染所致胃炎微環(huán)境中的一種重要成份，然而在H.pylori

2、導(dǎo)致的胃上皮細(xì)胞損傷或惡性轉(zhuǎn)化中MSCs究竟起何作用及其機(jī)制迄今仍不清楚。
　　因此，本研究旨在探討H.pylori對(duì)MSCs的影響及其對(duì)胃上皮細(xì)胞的作用及機(jī)制，試圖闡明MSCs參與H.pylori對(duì)胃損傷或胃癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移及治療中的作用及機(jī)制，為胃癌發(fā)生與診療提供新的依據(jù)。
　　方法:體外模擬體內(nèi)H.pylori(11637)感染過程，采用H.pylori(11637)活菌作為處理因素，與人臍帶來源的間質(zhì)干細(xì)胞(human

3、umbilical cord MSCs，hucMSCs)）以感染指數(shù)100∶1共培養(yǎng)24h，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，收集對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞用于后面的實(shí)時(shí)定量PCR及蛋白免疫印跡檢測(cè)相關(guān)基因，并收集共培養(yǎng)的上清3000轉(zhuǎn)每分鐘，離心5min，將上清置-80℃貯存?zhèn)溆?。所有?shí)驗(yàn)均在同等條件下重復(fù)3次。分別用實(shí)時(shí)定量RT-PCR、Westernblot方法檢測(cè)H.pylori作用前后MSCs中癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer associated

4、fibroblasts，CAFs)相關(guān)標(biāo)志分子(FAP、N-cadherin、Vimentin、α-SMA等)表達(dá)變化情況。采用Luminex及ELISA法檢測(cè)H.pylori作用hucMSCs后相關(guān)細(xì)胞因子的分泌情況。用Western blot法檢測(cè)H.pylori刺激培養(yǎng)后的hucMSC中NF-κB水平、NF-κB核轉(zhuǎn)位、磷酸化NF-κB及NF-κB抑制蛋白IκB-α的表達(dá)變化。應(yīng)用NF-κB特異性抑制劑PDTC預(yù)處理MSCs90m

5、in，再用H.pylori刺激培養(yǎng)hucMSCs，觀察其是否能干預(yù)H.pylori對(duì)MSCs的刺激效應(yīng)。采用MSCs培養(yǎng)上清及H.pylori與MSCs共培養(yǎng)的上清分別與正常胃上皮細(xì)胞(GES-1細(xì)胞)株共培養(yǎng)48h，觀察培養(yǎng)后的細(xì)胞形態(tài)變化，收集細(xì)胞并分別用實(shí)時(shí)定量RT-PCR和蛋白免疫印跡檢測(cè)共培養(yǎng)后胃上皮細(xì)胞/胃癌細(xì)胞中EMT相關(guān)標(biāo)志分子如E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等的表達(dá)情況。采用Transwe

6、ll法檢測(cè)不同上清處理后的GES-1細(xì)胞其遷移能力的變化。用手工計(jì)數(shù)法和MTT法檢測(cè)正常胃上皮細(xì)胞GES-1在不同條件培養(yǎng)基處理后的生長(zhǎng)曲線變化。應(yīng)用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三種培養(yǎng)基處理過的GES-1細(xì)胞的克隆形成能力。流式細(xì)胞術(shù)和蛋白免疫印跡法分別檢測(cè)細(xì)胞凋亡與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)三種培養(yǎng)基處理過的GES-1細(xì)胞癌基因、抑癌基因及干性相關(guān)基因(Sox2、Nanog及BMI)的變化。應(yīng)用NF-κB特異性抑制劑PDTC(10μM)預(yù)處

7、理MSCs90min，再用 H.pylori刺激培養(yǎng)hucMSCs，取其上清與GES-1細(xì)胞共培養(yǎng)48h作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)設(shè)立正常培養(yǎng)基和H.pylori刺激培養(yǎng)hucMSCs的上清再培養(yǎng)GES-1兩組，以觀察NF-κB參與MSCs轉(zhuǎn)化的同時(shí)，是否還參與轉(zhuǎn)化的間質(zhì)干細(xì)胞對(duì)胃上皮細(xì)胞的損傷作用。所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±SD方式表示，用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)作進(jìn)一步分析，多組間比較可用單因素方差分析法分析，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組間兩兩比較用Student

8、't-t檢測(cè)，如數(shù)據(jù)不滿足方差齊，則采用Tamhane'T2方法進(jìn)行結(jié)果校正。
　　結(jié)果: H.pylori刺激后的MSCs細(xì)胞形態(tài)更傾向于細(xì)長(zhǎng)，胞質(zhì)出現(xiàn)明顯的空泡變性，有CAFs樣成纖維細(xì)胞變化的傾向。實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示H.pylori作用24h后的MSCs中CAFs相關(guān)標(biāo)志分子Vimentin、N-cadherin、α-SMA及FAP等均有不同程度的升高(P＜0.05)。Luminex及EL

9、ISA法檢測(cè)H.pylori作用后的hucMSCs分泌大量細(xì)胞因子。H.pylori刺激的MSCs胞核中NF-κB含量升高，而胞質(zhì)中則下降，磷酸化的NF-κB在刺激組也是升高，存在時(shí)間依賴性，而NF-κB抑制蛋白IκB-α的表達(dá)下降。NF-κB特異性抑制劑PDTC抑制了H.pylori刺激的MSCs向CAFs樣成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，同時(shí)還抑制了H.pylori刺激MSCs時(shí)分泌增加的一些因子的表達(dá)。H.pylori刺激培養(yǎng)的hucMSCs上

10、清作用于GES-1細(xì)胞48h后，光學(xué)顯微鏡下觀察到GES-1細(xì)胞形態(tài)較正常對(duì)照組變的細(xì)長(zhǎng)如梭形，成纖維狀或紡錘形，細(xì)胞兩端尖細(xì)，細(xì)胞排列紊亂，部分細(xì)胞具有典型的間質(zhì)干細(xì)胞的表型，與EMT相關(guān)的間質(zhì)標(biāo)志物N型鈣粘蛋白(N-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)等基因表達(dá)明顯上調(diào)，而上皮標(biāo)物E-鈣粘蛋白(E-cadherin)基因表達(dá)明顯下降，這幾種分子的蛋白表達(dá)變化情況與mRNA變化趨勢(shì)一致。另外，結(jié)果還顯示體外經(jīng)H.pylor

11、i處理后的MSCs可以促使正常胃上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，其遷移能力、克隆形成能力及相關(guān)干性指標(biāo)(Sox2、Nanog和BMI)的表達(dá)均增強(qiáng)，凋亡相關(guān)基因的蛋白表達(dá)及原癌基因與抑癌基因之間的平衡也部分被打破。被H.pylori感染后轉(zhuǎn)化的間質(zhì)干細(xì)胞在促進(jìn)胃上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的同時(shí)，還使其獲得了部分在腫瘤細(xì)胞才能表現(xiàn)出來或典型表現(xiàn)的生物學(xué)特征或表型。采用H.pylori刺激PDTC預(yù)處理的hucMSCs上清并不能促使胃上皮細(xì)胞發(fā)生典型的EMT現(xiàn)

12、象。
　　結(jié)論: H.pylori能促使MSCs向癌相關(guān)成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并伴有相應(yīng)細(xì)胞因子的分泌。H.pylori對(duì)胃上皮細(xì)胞損傷或惡性轉(zhuǎn)化的方式之一，是通過誘使MSCs向CAFs樣轉(zhuǎn)化，再由CAFs樣轉(zhuǎn)化的成纖維細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)揮對(duì)胃上皮細(xì)胞的作用來實(shí)現(xiàn)的。H.pylori作用后的MSCs促進(jìn)胃上皮細(xì)胞/胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT，在腫瘤發(fā)生和進(jìn)一步的惡性轉(zhuǎn)化過程中起重要作用，這一作用機(jī)制與NF-κB信號(hào)通路活化有關(guān)。
　　本研