1、背景:幽門(mén)螺桿菌(H.pylori)在人群中,尤其是亞洲人群中的感染率很高.H.pylori的感染與消化性潰瘍、慢性萎縮性胃炎、胃粘膜相關(guān)淋巴樣組織淋巴瘤及胃癌的發(fā)生密切相關(guān).世界衛(wèi)生組織(WHO)下屬的國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)將H.pylori定為胃癌的I類(lèi)致癌原.但是H.pylori致病的確切機(jī)制仍不清楚,需要從細(xì)菌、宿主和環(huán)境因素共同探討. H.pylori感染胃上皮細(xì)胞,無(wú)論是在體標(biāo)本還是細(xì)胞系,都會(huì)改變其細(xì)胞動(dòng)力學(xué)

2、,但改變的模式不同.而細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的改變會(huì)破壞胃上皮細(xì)胞增殖與凋亡的平衡,與萎縮性胃炎、腸化、胃癌的發(fā)生密切相關(guān).研究H.pylori對(duì)胃上皮細(xì)胞株細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的影響及其機(jī)制能夠?qū).pylori與宿主細(xì)胞的相互作用進(jìn)行深入的探討,為明確H.pylori的致病機(jī)制提供更多的證據(jù). 近年的研究顯示H.pylori感染會(huì)抑制細(xì)胞熱休克蛋白70(heat shockprotein,lIsp70)的表達(dá),而HSP70是重要的分子伴侶,具有對(duì)

3、抗凋亡,促進(jìn)增殖的作用,與細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期及凋亡等密切相關(guān).我們假設(shè)H.pylori有可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞HSP70及相關(guān)蛋白如P21,PCNA等的表達(dá)而對(duì)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)產(chǎn)生影響,因此我們將通過(guò)以下三個(gè)步驟的研究,試圖弄清楚H.pylori的致病機(jī)川. 一、H.pylori對(duì)AGS細(xì)胞動(dòng)力學(xué)影響的觀察 目的:在體外觀察H.pylori感染對(duì)人AGS胃上皮細(xì)胞株的生長(zhǎng)情況、細(xì)胞活力和細(xì)胞周期的影響. 方法:不同

4、濃度比例的H.pylori與AGS細(xì)胞共培養(yǎng),在不同時(shí)間點(diǎn)觀察不同濃度H.pylori作用下AGS細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)情況,檢測(cè)細(xì)胞活力(MTT法).流式細(xì)胞儀檢測(cè)H.pylori對(duì)AGS細(xì)胞周期的影響;以不加H.pylori的AGS為空白對(duì)照組. 結(jié)果:與空白對(duì)照組相比,H.pylori作用的各組AGS細(xì)胞在共培養(yǎng)24h后細(xì)胞發(fā)生明顯的脫壁現(xiàn)象.貼壁細(xì)胞周邊及培養(yǎng)液中可見(jiàn)較多菌體,及細(xì)胞崩解后的殘留顆粒;并且這些表現(xiàn)隨著H.pyl

5、ori濃度的增高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯.4h后及8h后,與H.pylori共培養(yǎng)的各組AGS細(xì)胞活力均較對(duì)照組增加,其中4h后,細(xì)菌/細(xì)胞500:1組較空白對(duì)照組有顯著性差異(p<0.05);8h后, 200:1及100:1組較對(duì)照組也有顯著性差異(p<0.05;p<0.01).而24h后,不同濃度H.pyIori作用下各組AGS的細(xì)胞活力均較對(duì)照組下降,尤其是200:1組(p<0.01)和500:1組(p<0.001).48h后,H.

6、pylori作用下各組AGS的細(xì)胞活力較對(duì)照組下降更為顯著(p均<0.001),并且細(xì)菌濃度越高,細(xì)胞活力下降越明顯.與對(duì)照組相比,AGS細(xì)胞在H.pylori作用6h,12h及24h后G2和/或M期細(xì)胞的比例均明顯改變. 結(jié)論:H.pylori在體外與AGS細(xì)胞共培養(yǎng)可改變AGS的細(xì)胞動(dòng)力學(xué),作用早期短暫促細(xì)胞增殖;24h后可使AGS細(xì)胞發(fā)生G2和/或M期阻滯而顯著抑制細(xì)胞增殖,這一作用與細(xì)菌濃度及作用時(shí)間有關(guān). 二、

7、H.pylori對(duì)AOS細(xì)胞HSP70表達(dá)的影響 目的:體外觀察H.pylori感染對(duì)AGS細(xì)胞HSP70表達(dá)的影響. 方法:AGS細(xì)胞與H.pylori共培養(yǎng)48h并作空白對(duì)照,Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HSP70的含量. 結(jié)果:與空白對(duì)照組相比,H.pylori作用后AGS細(xì)胞HSP70表達(dá)明顯下降. 結(jié)論:H.pylori可減少AGS細(xì)胞HSP70的表達(dá). 三、H.pylori對(duì)HS

8、P70表達(dá)抑制的AGS細(xì)胞動(dòng)力學(xué)及P21、PCNA表達(dá)的影響 目的;探討H.pylori誘導(dǎo)AGS細(xì)胞動(dòng)力學(xué)改變的機(jī)制是否與HSP70抑制及P21,PCNA表達(dá)改變有關(guān). 方法:利用前期建立并鑒定完成的HSP70siRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞株及其空載體轉(zhuǎn)染AGS對(duì)照株將AGS細(xì)胞分成HSP70抑制組和非抑制組,觀察兩組細(xì)胞在ll.pylo"作用下的生長(zhǎng)情況、細(xì)胞活力,檢測(cè)P21,PCNA的表達(dá)情況. 結(jié)果:在H.

9、pylori作用下,隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),兩組細(xì)胞活力逐漸下降,尤其在48h及72h表現(xiàn)明顯.兩組間在4h,8h,24h沒(méi)有顯著性差異,而在48h,72h,HSP70siRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞活力較對(duì)照組低,具有顯著性差異(p<0.05).與對(duì)照組相比,HsP70siRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組AGS細(xì)胞P21含量明顯增加,PCNA則無(wú)明顯差異. 結(jié)論:H.pylori感染AGS細(xì)胞后,對(duì)HSP70抑制可進(jìn)一步加強(qiáng)H.pylori抑制AGS增