1、本研究應用RT—PCR方法克隆得到Cr3529差異表達基因BnCr4的編碼區(qū)cDNA序列。擴增并克隆到2個存在序列差異的同源cDNA全序列，分別命名為BnCr4-1和BnCr4-2。測序結(jié)果顯示，BnCr4-1編碼區(qū)序列長1311bp，編碼437個氨基酸，蛋白質(zhì)分子大小約49IKD；BnCr4-2編碼區(qū)序列大小為1389 bp，編碼463個氨基酸，蛋白質(zhì)分子量大小約為52．7kD。BnCr4、BnCr4-1和BnCr4-2的BLAST結(jié)

2、果表明它們與擬南芥中的一個未知功能基因的cDNA同源性分別為87％、80％和85％。對它們的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)進行了預測。結(jié)果顯示3個蛋白的N端約110aa以無規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角為主，定位于膜外側(cè)；中段約240aa含有豐富的二級結(jié)構(gòu)，構(gòu)成球狀的高級結(jié)構(gòu)域，位于膜的內(nèi)側(cè)；C端約100aa 以α-螺旋為主，位于膜外側(cè)。這3個蛋白質(zhì)都含有2個跨膜結(jié)構(gòu)域。BnCr4蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域位于256-284aa和414-437aa，BnCr4-1蛋白的

3、跨膜結(jié)構(gòu)域位于261-278aa和415-432aa，BnCr4-2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域位于262-279aa和417-435aa。功能預測顯示它們含有與蛋白質(zhì)的修飾作用有關(guān)的多個活性位點，如磷酸化、糖基化、酰胺化以及磷酸泛酰巰基乙胺結(jié)合位點，可能是一種新的與cAMP介導的蛋白質(zhì)磷酸化與去磷酸化作用有關(guān)的蛋白。根據(jù)原核表達載體pET-32a(+)的酶切位點及獲得的BnCr4的cDNA編碼區(qū)全序列設計引物，將這個基因的通讀框重組到原核表達載體

4、pETL32a(+)中。構(gòu)建重組表達載體pET-32a(+)-BnCr4，將其轉(zhuǎn)入宿主菌BL21(DE3)中，用IPTG誘導表達，對表達的蛋白用SDS—PAGE電泳分析，結(jié)果表明得到了與預計分子量相同的融合蛋白。根據(jù)植物表達載體pFGC5941的酶切位點，設計引物，上游引物含BaDtI位點，下游引物含XbaI位點，以pMD18-BnCr4質(zhì)粒為模板，擴增出一段長度為582bp片段。構(gòu)建重組質(zhì)粒pFGC9541-BnCr401并將其轉(zhuǎn)入根