1、背景:有絲分裂是細胞生命活動的重要特征之一,從十九世紀末發(fā)現(xiàn)至今一直受到科學家的高度重視和關注,經(jīng)過漫長的探索和研究,科學家們發(fā)現(xiàn)細胞有絲分裂是受時間和空間上的復雜、精巧的調(diào)控過程。細胞有絲分裂異常會導致非整倍體(aueuploidy)細胞的增加,與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有密切的聯(lián)系。
　　經(jīng)漫長的進化過程,細胞具備了能保證細胞周期DNA復制和染色體分配順利完成的檢查機制,被稱為細胞周期檢查點(cell cycle checkpoin

2、ts)。細胞周期檢查點的調(diào)控機制是保證細胞周期事件按次序、正常發(fā)生的細胞周期調(diào)控機制,也是細胞周期調(diào)控的關鍵因素。細胞周期檢查點的調(diào)控主要通過一系列酶來完成的,根據(jù)文獻報道,參與細胞有絲分裂重要的調(diào)控酶類主要有:Plk1, Cdk1等細胞周期依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs),PP1,Cdc14等細胞周期的磷酸酶,紡錘體組裝檢查點(spindle assembly checkpoint,SAC)

3、和E3泛素連接酶后期促進復合體等相關分子。
　　Plk1(Polo-like kinase1)是細胞周期有絲分裂重要的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶,在細胞有絲分裂進程中發(fā)揮極其重要的作用,在細胞周期不同亞期Plk1定位不同。到目前為止,已經(jīng)揭示有幾十個Plk1的底物,Plk1通過與這些底物相互作用來影響細胞周期有絲分裂的進入、紡錘體的形成、姐妹染色單體間的分離、中心體的復制以及胞質(zhì)分裂的過程;另外,Plk1本身的亞細胞定位也受相應底物的

4、調(diào)控。在人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中,最主要的表現(xiàn)為細胞增殖異常和遷移能力的增加,激酶 Plk1是調(diào)控細胞有絲分裂的關鍵分子,經(jīng)大量的研究證實在腫瘤細胞中Plk1具有明顯的高表達;在體外細胞培養(yǎng)和動物實驗中,低表達Plk1能夠有效地抑制腫瘤細胞的增殖并促進其自身凋亡,但對正常細胞沒有明顯的影響。因此,在人類腫瘤的治療中,Plk1激酶的靶向治療很可能成為的潛在新方法。
　　Erbin(ErbB2 Interacting protein)

5、定位于細胞膜和相鄰細胞連接處,最早在2000年以癌基因ErbB2為誘餌通過酵母雙雜交實驗時被發(fā)現(xiàn),并因此而命名。我們實驗室早期自主制備了Erbin抗體,在檢測Erbin抗體做免疫熒光時發(fā)現(xiàn),Erbin具有細胞周期依賴性表達升高和有絲分裂亞細胞動態(tài)定位的特征,這些研究結果提示Erbin在細胞周期中對細胞有絲分裂可能具有重要的調(diào)控作用。我們也發(fā)現(xiàn)Erbin具有有絲分裂依賴的磷酸化修飾特征,其磷酸化發(fā)生與Plk1的激活時程(time patt

6、ern)相似,且在細胞周期有絲分裂中存在明顯的亞細胞共定位(中心體和中體),由此提示Erbin可能是Plk1新的底物蛋白;因此,本課題擬通過分析Plk1與Erbin的相互作用,探討Erbin作為Plk1新的底物蛋白對細胞有絲分裂的調(diào)控作用及機制。
　　目的:在細胞水平上研究Erbin是否具有細胞周期依賴性的表達及其磷酸化,在細胞有絲分裂周期中Erbin亞細胞定位的變化,揭示Plk1對Erbin磷酸化的影響及其在細胞有絲分裂中亞細胞

7、共定位,Erbin與Plk1相互作用的結構域。初步探索Erbin對細胞有絲分裂的影響。
　　方法:通過細胞周期同步化實驗進一步觀察Erbin細胞周期依賴性的表達及其磷酸化特征,研究Erbin與Plk1在細胞有絲分裂中磷酸化的關系。利用免疫熒光(IF)檢測細胞周期中Erbin亞細胞定位的動態(tài)變化特征,檢測Erbin與Plk1在細胞周期有絲分裂中的共定位作用,檢測內(nèi)源和外源Erbin與Plk1相互作用的定位基礎,檢測Erbin不同截斷

8、體的定位從而確定Erbin的核定位基礎。利用分子生物學技術構建相應的載體,經(jīng)免疫共沉淀(Co-IP)實驗初步證實內(nèi)源和外源Erbin與Plk1存在相互作用,利用Erbin和Plk1的不同結構域的截斷體進一步證實Erbin與Plk1相互作用的結構域,并且經(jīng)過GST-Pull down實驗進一步佐證Erbin與Plk1的相互作用及其二者相互作用的結構域。經(jīng)過序列比對分析實驗,推測并證實Cdk1是Plk1磷酸化Erbin的點火激酶。利用Erb

9、in siRNA干涉實驗證明Erbin敲低對Plk1磷酸化的影響;利用流式細胞術,經(jīng)Nocodazole同步化(M)釋放實驗,PI染色檢測Erbin siRNA干涉后對細胞周期的影響;經(jīng)DAPI和Golgin-97染色細胞核和高爾基體,檢測Erbin敲低對細胞有絲分裂細胞核的影響;在正常人乳腺細胞MCF-10A中敲低Erbin表達,在倒置顯微鏡下有絲分裂細胞數(shù)的變化。
　　結果:首先我們利用抗微管藥物Nocodazole處理細胞使

10、細胞阻滯于G2/M期,分析G2/M期細胞裂解樣品中Erbin蛋白在電泳中的泳動,結果觀察到其遷移明顯變緩,而在λ磷酸酶處理可以翻轉Nocodazole引起的Erbin條帶遷移變緩現(xiàn)象,證實磷酸化修飾是引起Erbin在G2/M期條帶上移的原因,進一步用雙胸腺嘧啶使細胞阻滯于G1/S期,然后釋放,觀察細胞在自然進入M期時 Erbin條帶泳動的變化,結果發(fā)現(xiàn)Erbin在從G2進入M期(T9-T11)時條帶明顯上移,并與激酶Plk1的活化pat

11、tern一致;而敲低Plk1可抑制Nocodazole引起的Erbin條帶上移,表達激活型Plk1和野生型Plk1可直接導致外源表達的Erbin條帶上移(轉染失活型的Plk1無此作用),以上實驗結果證實M期Erbin磷酸化依賴于激酶Plk1。此外我們亦初步證實Cdk1是Plk1磷酸化Erbin的點火激酶。進一步我們利用免疫熒光觀察細胞周期中的Erbin具有明顯的中體和中心體定位,在有絲分裂前、中期Erbin與Plk1在中心體具有明顯的共

12、定位,在末期和胞質(zhì)分裂期兩者在中體有明顯的共定位。免疫共沉淀實驗證實Erbin-PDZ結構域與Plk1的催化區(qū)(Plk1-CD)相互作用,而Erbin-Inter區(qū)只與活化的Plk1發(fā)生相互作用。并GST-Pull down實驗亦進一步佐證Erbin與Plk1的相互作用,即Erbin-PDZ不與Plk1-PBD結合,而與Plk1-CD結合,而Plk1-PBD與磷酸化的Erbin-Inter區(qū)有更強的體外作用。這些相互作用實驗結果提示,E

13、rbin是Plk1新的底物,Erbin被磷酸化的底物區(qū)域存在于Erbin-Inter區(qū),而Erbin-PDZ可能調(diào)控Plk1的活性。我們亦進一步證實了過表達PDZ對Plk1磷酸化的抑制作用和延緩有絲分裂進入。我們也觀察到慢病毒感染敲低Erbin15天后,細胞明顯分裂異常,主要表現(xiàn)為多核細胞顯著增強。
　　結論:本研究證明了Erbin具有細胞周期依賴性的表達及細胞周期有絲分裂的亞細胞定位動態(tài)特征,并且具有有絲分裂依賴的磷酸化修飾現(xiàn)象

14、,與Plk1激酶存在明顯的相互作用,并且初步驗證Cdk1是Plk1磷酸化Erbin中的“點火”(priming)激酶,Plk1磷酸化Erbin的底物結合區(qū)存在于Erbin-Inter區(qū),而Erbin-PDZ結構域通過與Plk1-CD結構域結合,可能空間位阻上干擾Plk1 T210的激活。以上結果提示,Erbin即作為Plk1的底物又可負調(diào)控Plk1活性,Erbin是一個重要的新的有絲分裂調(diào)控分子。Erbin敲低明顯促進了細胞的增殖以及多