1、腸道細菌感染為常見的消化道疾病。致病菌大多是革蘭陰性菌，通常引起腹瀉、腹痛、發(fā)熱甚至引起全身性感染。目前針對腸道細菌感染主要是使用抗生素進行抗菌治療。但隨著抗生素的不合理應用、濫用以及口服抗菌藥物應用的增多，消化道致病菌的耐藥性問題正變得日益嚴重。對于耐藥性細菌腸道感染的治療，新型抗菌藥物的開發(fā)和應用變得尤為重要。 抗菌肽（antimicrobial peptide）是一類具有抗菌活性的多肽，在生物體的天然免疫中起著重要作用?？?/p>

2、菌肽具有廣譜、高效抗菌活性，與其他抗菌藥物多無交叉耐藥性，而且不易誘導耐藥菌株的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽Bactenecin7（Bac7）對革蘭陰性菌具有高效抗菌活性，除直接殺菌作用外，Bac7還有中和內(nèi)毒素、抗炎、免疫誘導、組織修復等功能。顯然抗菌肽Bac7在腸道細菌感染治療中具有眾多優(yōu)勢，有望成為治療革蘭陰性細菌引起的腸道感染的新一代抗菌藥物。 研究目的: 構(gòu)建攜抗菌肽Bac7基因的表達載體并在乳酸乳球菌中高效分泌表達

3、，為抗菌肽Bac7治療腸道革蘭陰性菌感染的合理安全應用提供理論與實驗依據(jù)。同時構(gòu)建攜抗菌肽Bac7基因的乳酸乳球菌MG1363（L。Lactis MG1363）的同源重組載體，為進一步研究轉(zhuǎn)抗菌肽Bac7基因乳酸乳球菌治療腸道感染奠定基礎。 研究方法: 1.抗菌肽Bac7分泌表達載體的構(gòu)建：根據(jù)乳酸乳球菌對密碼子的偏愛性和Genbank中Bac7蛋白序列，設計并化學合成Bac7基因序列以及分泌信號肽（SPUSP）序列和增

4、強表達序列（Leisstcda）的拼接引物，采用重疊延伸PCR方法，拼接合成Bac7基因及其相關調(diào)控元件序列，并將其克隆至載體pMG36e中構(gòu)建重組載體pMG36e-Bac7。 2.抗菌肽Bac7抗血清的制備：利用軟件DNASTAR預測抗菌肽Bac7的抗原決定簇，采用化學合成法合成其抗原決定簇序列（N-端20個氨基酸）。將合成的多肽與鑰孔血藍蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）偶聯(lián)、純化后免疫家兔。

5、制備的抗血清經(jīng)鹽析純化后用SDS-PAGE和ELISA方法進行抗體的純度和滴度測定。 3.L.lactis MG1363的電擊轉(zhuǎn)化：通過試驗確定最適電轉(zhuǎn)化條件，并在此條件下將重組質(zhì)粒pMG36e-Bac7電擊轉(zhuǎn)化至L.lactis MG1363中。挑取單菌落增菌后提取質(zhì)粒進行PCR鑒定，進一步將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，提取質(zhì)粒做雙酶切鑒定。 4.抗菌肽Bac7基因在L.lactis MG1363中的分泌、表達情況分

6、析：采用RT-PCR方法檢測Bac7基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達。通過Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析Bac7基因在L.lactis MG1363中的表達、分泌情況。 5.表達產(chǎn)物生物活性的初步檢測：采用超濾離心法將L.lactisMG1363培養(yǎng)液上清中表達產(chǎn)物進行濃縮。瓊脂擴散法檢測濃縮上清中抗菌肽Bac7對大腸桿菌和陰溝腸桿菌的抑菌活性。 6.攜Bac7基因的L.lactis MG1363同源

7、重組載體的構(gòu)建：根據(jù)L.lactis MG1363基因組中的胸腺嘧啶合成酶基因（thymidylate synthase gene，ThyA）序列設計引物，以L.lactis MG1363基因組DNA為模板，PCR擴增ThyA基因起始密碼上游及下游各約1000bp左右的堿基序列，并將其依次克隆至載體pMUTIN4中，再將Bac7基因插入載體多克隆位點構(gòu)建出同源重組載體pThyA-Bac7。 研究結(jié)果: 1.經(jīng)重疊延伸PC

8、R方法成功拼接合成Bac7及其相關調(diào)控元件序列并將其克隆至載體pMG36e，構(gòu)建了重組載體pMG36e-Bac7，經(jīng)雙酶切鑒定并進一步測序確證，結(jié)果顯示目的基因與設計序列完全一致。 2.成功制備了兔抗Bac7多克隆抗體，抗體經(jīng)鹽析純化后進行SDS-PAGE，電泳結(jié)果顯示制備的抗體純度較高。進一步用ELISA方法測定抗體效價，效價達1：10000。 3.初步確定了L.lactis MG1363最適電轉(zhuǎn)化參數(shù)：電壓10kV/

9、cm，電阻200Ω，電容25μF，電擊時間5.0ms。通過電擊成功地將重組質(zhì)粒導入L.lactis MG1363中。RT-PCR、Western blot檢測結(jié)果表明，抗菌肽Bac7可有效表達，并分泌于L.lactis MG1363培養(yǎng)液上清中。 4.瓊脂擴散法檢測結(jié)果證明，表達產(chǎn)物抗菌肽Bac7在體外能有效抑制大腸桿菌和陰溝腸桿菌的生長。 5.成功構(gòu)建了L.lactis MG1363同源重組載體pThy-Bac7，經(jīng)雙

10、酶切鑒定和進一步測序鑒定，結(jié)果與預期完全一致。 研究結(jié)論: 1.攜重組質(zhì)粒pMG36e-Bac7的L.lactis MG1363能有效表達、分泌抗菌肽Bac7，表達分泌于培養(yǎng)液上清的抗菌肽Bac7在體外能有效殺滅大腸桿菌和陰溝腸桿菌。 2.成功制備了抗菌肽Bac7多克隆抗體。 3.成功構(gòu)建了攜抗菌肽Bac7基因的L.lactis MG1363同源重組載體pThy-Bac7，為實現(xiàn)Bac7基因在乳酸菌中的整