1、神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells,NSCs）自被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，因其特有的自我更新、多向分化潛能，較低的免疫原性等諸多優(yōu)點(diǎn)而倍受神經(jīng)科學(xué)界關(guān)注。但將 NSCs用于治療疾病還存在很多亟待解決的問(wèn)題。本研究采用原代細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，改進(jìn)傳代培養(yǎng)中分離單細(xì)胞的方法，用EPO促進(jìn)NSCs增殖，將GDNF基因?qū)肷窠?jīng)干細(xì)胞，免疫熒光標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)體外基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化率，為該細(xì)胞的在體移植和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。
　　第一部分胚

2、鼠腦源性神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定
　　目的：提高胚鼠腦源性神經(jīng)干細(xì)胞克隆形成率，為GDNF基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞的制備和在體移植奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　第一步：胚鼠腦源性神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)
　　取13~14d的SD胚鼠，剝離腦皮層，經(jīng)漂洗、剪碎、吹打、過(guò)濾后采用無(wú)血清懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。
　　第二步：細(xì)胞傳代
　　原代培養(yǎng)6~7d后傳代，分兩組，一組采用逐步分批吹打法，另一組采用一次性吹打法，比較兩組細(xì)胞生

3、長(zhǎng)狀況。
　　第三步：鑒定神經(jīng)干細(xì)胞
　　采用Nest in免疫熒光標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞，熒光顯微鏡檢測(cè)結(jié)果。
　　第四步：檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞分化情況
　　傳至3代的神經(jīng)干細(xì)胞加血清誘導(dǎo)分化，第5d免疫熒光標(biāo)記檢測(cè)神經(jīng)元的標(biāo)志物NSE和星型膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物GFAP。
　　第五步：MTT法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)活力，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。
　　第六步：檢測(cè)促紅細(xì)胞生成素對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖影響
　　兩種吹打方法組傳2代

4、后，各組又分4個(gè)亞組，每亞組分別按0U/ml,50U/ml，100U/ml，150U/ml的濃度加入EPO，于培養(yǎng)第5d進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，分析EPO對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果：神經(jīng)干細(xì)胞傳代后從第3d增殖開(kāi)始加快，4~6d增殖明顯加快，然后處于相對(duì)穩(wěn)定期。神經(jīng)干細(xì)胞及其分化細(xì)胞免疫熒光鑒定呈陽(yáng)性。逐步吹打組比一次性吹打組神經(jīng)球大且數(shù)目相對(duì)多。培養(yǎng)液中加入EPO后，隨劑量的增加，細(xì)胞增殖加快，逐步吹打組0U/ml、50U/ml、

5、100U/ml和150U/mlEPO各劑量組神經(jīng)干細(xì)胞記數(shù)分別為(33.96±6.54)×104個(gè)/ml、(36.67±7.77)×104個(gè)/ml、(43.13±8.43)×104個(gè)/ml和(51.04±10.62)×104個(gè)/ml。
　　結(jié)論：成功培養(yǎng)了具有自我更新和多向分化潛能的神經(jīng)干細(xì)胞；逐步分批吹打組細(xì)胞增殖快于一次性吹打組；EPO能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖及存活。
　　第二部分GDNF基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞及其分化

6、　　目的：獲得轉(zhuǎn)染GDNF基因的神經(jīng)干細(xì)胞，檢測(cè)此種細(xì)胞向神經(jīng)元和星型膠質(zhì)的分化率，為基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞的在體移植奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　第一步：質(zhì)粒的提取
　　將含peGFP-GDNF質(zhì)粒的大腸桿菌接種入LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，搖菌，提取質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
　　第二步：脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞
　　采用適合懸浮細(xì)胞的DMRIE-C Reagent脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，將重組質(zhì)粒peGFP-GDNF轉(zhuǎn)染到胚鼠皮

7、層神經(jīng)干細(xì)胞。熒光倒置顯微鏡觀察GFP蛋白的表達(dá)。第三步：GDNF基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞體外分化的檢測(cè)
　　分三組：第一組為陰性對(duì)照，第二組轉(zhuǎn)染 peGFP-N1質(zhì)粒組為陽(yáng)性對(duì)照，第三組轉(zhuǎn)染peGFP-GDNF質(zhì)粒。各組于轉(zhuǎn)染后第2d加入胎牛血清誘導(dǎo)細(xì)胞分化，7d后免疫熒光標(biāo)記檢測(cè)，分別計(jì)數(shù)各組神經(jīng)元及星型膠質(zhì)細(xì)胞個(gè)數(shù)，計(jì)算其分化率。結(jié)果：神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)基因后36小時(shí)目的基因開(kāi)始表達(dá)，并逐漸增強(qiáng)，20天左右開(kāi)始下降，基因的表達(dá)至少能維持