1、背景與目的：肺癌是現(xiàn)今社會(huì)人類常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，它在全世界各類癌癥中死亡率是最高的。肺癌可分為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(SCLC)兩種類群，其中非小細(xì)胞肺癌大約占肺癌的85％，小細(xì)胞肺癌約占15%。由于有效的早期診斷技術(shù)和治療措施的缺乏，非小細(xì)胞肺癌通常在晚期才被診斷，預(yù)后較差。因此，為了預(yù)防和治療肺癌而對(duì)NSCLC致病機(jī)制進(jìn)行深入的研究是非常重要的。TGF-β信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮重要的作用。RNF111基

2、因編碼的蛋白Arkadia可以通過(guò)降解TGF-β信號(hào)通路中的負(fù)調(diào)控因子Smad7，SnoN和Ski來(lái)增強(qiáng)TGF-β信號(hào)通路。DNA的甲基化被認(rèn)為是最典型導(dǎo)致基因表達(dá)或者沉默的表觀機(jī)制，并且與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究中，我們研究RNF111基因在非小細(xì)胞肺癌和人支氣管上皮細(xì)胞株中mRNA表達(dá)水平，并研究不同細(xì)胞株中mRNA表達(dá)水平的差異是基因突變還是基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化導(dǎo)致的，為NSCLC的早期診斷和治療提供新穎的理論依據(jù)。
　

3、　 方法：利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-Time PCR）檢測(cè)3株細(xì)胞株(HBE、95C和95D)中RNF111基因mRNA表達(dá)水平；并用SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism)的方法檢測(cè)RNF111基因啟動(dòng)子區(qū)和編碼蛋白功能區(qū)的基因突變情況；同時(shí)利用BSP和克隆測(cè)序的方法分析95C和95D細(xì)胞株中RNF111基因啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，并對(duì)兩株細(xì)胞株中甲基化狀態(tài)有顯著差異

4、的CpG位點(diǎn)的甲基化頻率進(jìn)行計(jì)算，統(tǒng)計(jì)這些CpG位點(diǎn)甲基化頻率的差異是否與其mRNA表達(dá)水平的差異相關(guān)；另外，利用EMSA(electrophoretic mobility shift assay)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，驗(yàn)證甲基化頻率有差異的CpG位點(diǎn)是否是通過(guò)與特定轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合來(lái)影響RNF111基因的mRNA表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果顯示在三株細(xì)胞株中RNF111基因的mRNA表達(dá)水平在95C和95D之間的差異最為顯著

5、并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，暗示該基因可能與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)移程度相關(guān)。
　　 SSCP結(jié)果顯示，在非小細(xì)胞肺癌組織和相應(yīng)的癌旁組織以及三株細(xì)胞株中RNF111基因的啟動(dòng)子區(qū)和功能區(qū)均無(wú)突變發(fā)生，說(shuō)明該基因mRNA表達(dá)水平的差異不是由基因突變引起的；BSP和克隆測(cè)序的結(jié)果顯示，在基因啟動(dòng)子區(qū)的-309、-109和+3位置的CpG位點(diǎn)甲基化頻率在95C和95D兩株細(xì)胞株中有顯著差異。-309位置的CpG位點(diǎn)甲基化的頻率在95C和

6、95D細(xì)胞株中分別是0%和40%;-109位置的CpG位點(diǎn)甲基化的頻率分別是45%和O%；+3位置的CpG位點(diǎn)甲基化的頻率分別是35%和5%，差異顯著并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。說(shuō)明RNF111基因啟動(dòng)子區(qū)的-309、-109和+3位置的CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)可能調(diào)控該基因的轉(zhuǎn)錄水平，導(dǎo)致兩株細(xì)胞株之間mRNA表達(dá)水平的差異。EMSA結(jié)果顯示，針對(duì)-309、-109和+3位置的CpG位點(diǎn)設(shè)計(jì)的探針均可以與核蛋白結(jié)合，且只有針對(duì)-3

7、09位置CpG位點(diǎn)設(shè)計(jì)的未甲基化和甲基化的探針結(jié)合蛋白的量存在差異，暗示該位點(diǎn)可能是影響基因轉(zhuǎn)錄的重要原因。
　　 結(jié)論：我們的研究發(fā)現(xiàn)RNF111基因的mRNA在95D細(xì)胞株中表達(dá)量最高且與95C存在顯著差異，說(shuō)明該基因可能與肺癌惡性轉(zhuǎn)移有關(guān)。SSCP結(jié)果顯示該表達(dá)量的變化不是由基因突變引起的。BSP和克隆測(cè)序結(jié)果表明該基因啟動(dòng)子區(qū)-309、-109和+3位置的CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)在兩株細(xì)胞中有顯著差異。EMSA實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證這些

8、位點(diǎn)均可以與核蛋白結(jié)合，并且-309位置的CpG位點(diǎn)未甲基化與甲基化時(shí)結(jié)合的蛋白量存在差異，說(shuō)明該位點(diǎn)甲基化狀態(tài)可能是影響基因轉(zhuǎn)錄的重要原因。該位點(diǎn)的結(jié)合蛋白可能是負(fù)向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，由于95D細(xì)胞株該位點(diǎn)的甲基化而降低負(fù)向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，導(dǎo)致mRNA表達(dá)量升高。至于該結(jié)合蛋白是否是轉(zhuǎn)錄因子，接下來(lái)還需要通過(guò)打質(zhì)譜來(lái)證明。RNF111基因啟動(dòng)子區(qū)-309位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)與mRNA水平密切相關(guān)，這為NSCLC的早期診斷和抗腫瘤藥物的研發(fā)