1、背景與目的 肺癌是當(dāng)今最普遍以及死亡率最高的惡性腫瘤之一。肺癌的發(fā)生是一個(gè)多基因參與、多階段發(fā)展的過程，是環(huán)境因素與遺傳因素相互作用的結(jié)果，一方面機(jī)體暴露于環(huán)境危險(xiǎn)因素而導(dǎo)致DNA損傷促使原癌基因激活和／或抑癌基因失活。另一方面基因多態(tài)性的存在使攜帶易感基因型的個(gè)體少量地暴露于環(huán)境危險(xiǎn)因素即可發(fā)病。烷化劑是重要晶化學(xué)致癌物質(zhì)，作用機(jī)制為形成0。一甲基鳥嘌呤(06一methlyguanine，06-MedG)，導(dǎo)致DNA發(fā)生G：C

2、—A：T突變，06-甲基鳥嘌呤一DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(06-methylguanineDNAmethyltransferaseMGMT)，可特異性切除并修復(fù)06-甲基鳥嘌呤，維持基因組穩(wěn)定性。MGMT基因的失活常導(dǎo)致原癌基因的激活。ras基因是一種重要的細(xì)胞原癌基因，其家族由k-ras，h-ras，r-ras三個(gè)關(guān)系密切的成員組成，其中k-ras基因與肺癌的關(guān)系最為密切，被認(rèn)為是“啟動(dòng)”癌變的關(guān)鍵基因之一。本研究采用免疫組織化學(xué)與甲基化特異

3、性PCR的方法，研究在非小細(xì)胞肺癌組織中MGMT啟動(dòng)子過甲基化狀況及MGMT、K-ras的表達(dá)與相關(guān)性，探討MGMT在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為肺癌的基因診斷提供理論基礎(chǔ)。 材料與方法 試驗(yàn)組為手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本60例。其中男性32例，女性28例，年齡最小32歲，最大72歲，平均45．3歲。肺鱗癌38例，高分化鱗癌14例，中分化鱗癌12例，低分化鱗癌12例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者24例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者1

4、4例；腺癌22例，高分化腺癌14例，中分化腺癌12例，低分化腺癌12例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者12例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者lO例；38例吸煙者中，腺癌14例，鱗癌24例，22例非吸煙者中，腺癌8例，鱗癌12例。腫瘤體積≥3cm的36例，腫瘤體≤3cm的24例。按1997年國際抗癌協(xié)會(huì)P—TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，I～I(xiàn)I期24例，III～Ⅳ期36例。對(duì)照組為癌旁組織，距腫瘤至少5~m，病理診斷為正常肺組織。標(biāo)本來自鄭州大學(xué)一附院2004—2005年胸外科手術(shù)病

5、人，這些病人術(shù)前未經(jīng)放療及抗癌化學(xué)藥物治療．標(biāo)本一部分立即放入一80'C冰箱，待PCR用；相應(yīng)一部分標(biāo)本經(jīng)10％福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，切成4μm的切片，分別進(jìn)行蘇木素一伊紅(眥)染色及MGMT、K—ras免疫組化染色。結(jié)果應(yīng)用SPSSIO．O軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。MGMT、K—ras蛋白陽性率，MGMT啟動(dòng)子過甲基化率采用X2檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析方法，a=0．05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。 結(jié)果 1、60

6、例非小細(xì)胞肺癌組織中MGMT啟動(dòng)子過甲基化率35％(21／60)，正常肺組織中的過甲基化率11.7％(7／60)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

7、5)。MGMT基因啟動(dòng)子過甲基化與肺癌患者年齡、性別、吸煙史、腫瘤大小、及腫瘤分化程度的無關(guān)。 2、60例非小細(xì)胞肺癌組織中MGMT陽性表達(dá)率為3396(20／60)；正常肺組織中MGMT蛋白陽性表達(dá)率為63％(38／60)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(尸<0．05)。年齡、性別、腫瘤大小、組織學(xué)類型、，P-TNM分期與MGMT蛋白的表達(dá)間無關(guān)(尸>O．05)，而吸煙史、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與MGMT蛋白的表達(dá)有關(guān)(尸

8、T蛋白的高表達(dá)在有吸煙史，腫瘤分化程度高的患者中，在伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中低表達(dá)。 3、60例非小細(xì)胞肺癌組織中K—ras蛋白的陽性表達(dá)率為6396(38／60)；正常肺組織中K-ras蛋白陽性表達(dá)率為30％(18／60)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0．05)；而組織學(xué)類型、吸煙史、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與K—fas蛋白的表達(dá)有顯著差異(P<0．05)。K—

9、fas蛋白更易表達(dá)于有吸煙史的肺腺癌患者，腫瘤體積大，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中。 4、20例MGMT陽性表達(dá)者中K—ras表達(dá)陽性4例(20％)，40例MGMT陰性表達(dá)者中K—ras表達(dá)陽性34例(85％)，經(jīng)Spearmans相關(guān)分析，r=一0．036，P<0．01，說明在非小細(xì)胞肺癌患者中MGMT與K—fas蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。 5、21例MGMT基因啟動(dòng)子過甲基化NSCLC組織中MGMT陽性表達(dá)2例(9．5％)，39例

10、MGMT基因啟動(dòng)子非過甲基化NSCLC組織中MGMT陽性表達(dá)18例(41％)，經(jīng)Spearmans相關(guān)分析，r=-0．445，尸<0．05，說明在非小細(xì)胞肺癌患者中MGMT基因啟動(dòng)子過甲基化與MGMT蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。 結(jié)論 l、MGMT蛋白在非小細(xì)胞肺癌中低表達(dá)，與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示MGMT表達(dá)缺失可能與肺癌發(fā)生、進(jìn)展有關(guān)；MGMT蛋白在腫瘤及正常組織中表達(dá)的不同，提示其可能為腫瘤的診斷提供新思路。

11、 2、非小細(xì)胞肺癌中MGMT啟動(dòng)子過甲基化顯著高于正常肺組織，與MGMT蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示啟動(dòng)子過甲基化可能是MGMT表達(dá)調(diào)控的主要方式；檢測(cè)MGMT啟動(dòng)子過甲基化可能對(duì)肺癌的輔助診斷有一定意義。 3、K—fas蛋白更易表達(dá)于有吸煙史的肺腺癌患者中，腫瘤體積大伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中表達(dá)高，提示K-ras可能與肺腺癌的惡性演變關(guān)系密切。 4、MGMT的表達(dá)與原癌基因K-ras的激活呈負(fù)相關(guān)，二者相互協(xié)調(diào)、共同參與