1、【背景與目的】
　　肺癌是人類常見的惡性腫瘤之一，其死亡率居各類腫瘤死亡原因之首。肺癌按組織病理學可分為非小細胞肺癌（NSCLC）和小細胞肺癌(SCLC)兩大類，前者占肺癌患者總數(shù)85%以上。肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，TGF-β信號通路發(fā)揮了極其重要的作用。TGF-β在腫瘤早期有抑制腫瘤細胞生長發(fā)育的抑癌作用，但在惡性腫瘤晚期反而促進腫瘤轉(zhuǎn)移播散起著促癌作用。ENG基因編碼的endoglin蛋白是TGF-β受體復合物重要組成部分，通過

2、ALK1和ALK5增強smad1、smad2而抑制smad3通路。DNA的甲基化是導致基因表達或者沉默的最典型表觀機制，并且與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究主要目的是，了解ENG基因在非小細胞肺癌中mRNA、蛋白表達水平，并進一步探索其表達差異與ENG基因近端啟動子區(qū)及5’-UTR區(qū)甲基化狀態(tài)之間的關(guān)系，旨在為非小細胞肺癌早期診斷、轉(zhuǎn)移復發(fā)、療效評估、生存預后提供一定理論依據(jù)。
　　【方法】
　　利用熒光實時定量 PCR（R

3、eal-Time PCR）檢測人支氣管上皮細胞株(HBE)和4株非小細胞肺癌細胞株（A549、H1299、95C和95D）以及22對NSCLC癌與癌旁組織標本中ENG基因mRNA表達水平；并運用western blot方法檢測ENG在上述樣本中蛋白表達水平；采用BSP和TA克隆測序方法對5株細胞（HBE、A549、H1299、95C和95D）以及3對IV期NSCLC癌與癌旁組織標本ENG基因近端啟動子區(qū)和5’-UTR區(qū) CpG位點甲基化

4、狀態(tài)進行分析；選取 A549、95D細胞株，利用5-Aza-2’-deoxycytidine去甲基化藥物處理細胞，再次運用熒光實時定量 PCR方法檢測藥物處理組與未處理對照組細胞株中ENG的表達差異，并進一步利用BSP和TA克隆測序方法分析藥物處理組細胞株5’-UTR區(qū)CpG位點甲基化狀態(tài)。
　　【結(jié)果】
　　1.熒光實時定量 PCR實驗結(jié)果顯示，ENG基因 mRNA在高轉(zhuǎn)移性肺癌細胞H1299、95D細胞株中高表達，而在人

5、正常支氣管上皮細胞株 HBE和低轉(zhuǎn)移性肺癌細胞A549、95C細胞株中表達缺失，且H1299和95D中的相對表達量之間存在顯著性差異(P<0.001)；在22對NSCLC癌與癌旁組織標本中，ENG基因mRNA在19/22例癌組織中顯著高表達(P<0.0001),并與肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P=0.02）;Western blot實驗結(jié)果表明，ENG基因編碼蛋白endoglin在上述樣本中的表達水平與mRNA表達水平一致。實驗結(jié)果提示ENG基

6、因高表達可能與非小細胞肺癌的惡性轉(zhuǎn)移程度相關(guān)。
　　2. ENG基因近端啟動子區(qū)和5’-UTR區(qū)共2414bp， CpG位點68個，5’-UTR區(qū)含有1個CpG島。BSP結(jié)果顯示ENG啟動子區(qū)散在的10/37個CpG位點甲基化頻率存在顯著差異(P<0.05)，5’-UTR區(qū)CpG島除了+130位點以外的27個CpG位點甲基化頻率均存在顯著差異(P<0.05)。結(jié)合細胞株中ENG表達量情況分析發(fā)現(xiàn)CpG島甲基化與ENG表達量呈反比。

7、
　　3.去甲基化藥物5-Aza-2’-deoxycytidine處理A549、95D細胞后，BSP和TA克隆測序?qū)嶒炗^察ENG基因5’-UTR區(qū)CpG島位點甲基化情況，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域在A549和95D細胞株中甲基化頻率均下調(diào)；熒光實時定量PCR和western blot實驗結(jié)果均顯示ENG基因在95D細胞株中表達量下調(diào)（P<0.0001），而在A549細胞株中無明顯變化。
　　【結(jié)論】
　　1. ENG基因mRNA及蛋白