1、復(fù)旦大學(xué)碩士學(xué)位論文提高重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)量和特異性的研究姓名：張靜申請學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：鐘江20060527復(fù)旦大學(xué)碩士學(xué)位論文提高重組桿裝病毒的表達(dá)量和特異性的研究摘要重組昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(recombinantbaculovirusexpressionsystem)在昆蟲細(xì)胞中由于具有表達(dá)量高，不易形成包涵體，有一定的轉(zhuǎn)錄后修飾等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于真核蛋白的表達(dá)。起初，人們以為桿狀病毒只能感染昆

2、蟲鱗翅目家族的成員，然而在1983年Volkman和Goldsmith首次發(fā)現(xiàn)了桿狀病毒也可以進(jìn)入脊椎動(dòng)物細(xì)胞。這一革命性的報(bào)道從此揭開了桿狀病毒作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移載體的研究?，F(xiàn)在已有的文獻(xiàn)證明桿狀病毒可以感染多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞，尤其是對肝細(xì)胞具有較強(qiáng)的偏好性。其具體的進(jìn)入途徑雖然還不是十分明了，不過研究顯示是和細(xì)胞非特異性的胞吞作用相關(guān)。桿狀病毒作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移的載體有很多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。譬如：安全性好，不能復(fù)制傳代；對外源基

3、因的容量大，其核衣殼至少可以容納lOOkb的外源基因；毒副作用小，即使在高M(jìn)OI感染時(shí)也不會(huì)引起細(xì)胞毒性。鑒于桿狀病毒對于肝細(xì)胞較高的感染率，一些試圖將桿狀病毒改造成肝細(xì)胞特異性基因表達(dá)載體的研究已有所報(bào)道。例如在重組桿狀病毒表達(dá)框中引入肝癌細(xì)胞特異性甲胎蛋白(AFP)的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，以此將外源基因選擇性的導(dǎo)入肝癌細(xì)胞中。但是桿狀病毒作為真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移的載體還有一些自身無法克服的缺點(diǎn)。如：在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不能復(fù)制，引入的外源基因表達(dá)

4、量不高等問題。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的目的就在于改造重組桿狀病毒表達(dá)載體，以期能提高外源基因的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)選用了AFP增強(qiáng)子(enhancer)和HS4絕緣子(insulator)兩個(gè)調(diào)控元件，以及綠色熒光蛋白(GFP)報(bào)告基因來構(gòu)建重組桿狀病毒。其中綠色熒光蛋白表達(dá)框?yàn)镃MV和p10雙啟動(dòng)子。雙啟動(dòng)子便于在昆蟲細(xì)胞中篩選重組病毒。選用AFPenhancer一方面是為了維持其肝癌細(xì)胞特異性另一方面是為了提高GFP的表達(dá)。選用HS4insulator