1、本論文主要涉及了三個(gè)蛋白的基因克隆表達(dá)及相關(guān)抑制劑篩選的研究，主要包括與糖尿病綜合癥及炎癥相關(guān)的醛糖還原酶和醛還原酶，以及一種具有腦靶向作用的多亞基全新的霍亂毒素類似嵌合蛋白的基因克隆表達(dá)和純化，及采用醛糖還原酶和醛還原酶進(jìn)行抑制劑的篩選，主要得到的結(jié)果有以下三種。
　　第一，醛糖還原酶(Aldehyde reductase AKR1B1，EC1.1.1.21)是醛酮還原酶家族成員，是多元醇通路的關(guān)鍵限速酶。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，A

2、KR1B1與多種疾病有關(guān)，在一系列的炎癥性疾病等中起著關(guān)鍵作用，與多種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生有直接的關(guān)系，可作為篩選非甾體抗炎藥物的新靶點(diǎn)。為了篩選相應(yīng)的酶抑制劑，為藥物開發(fā)及臨床應(yīng)用提供參考，本研究構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-22b-AKR1B1-(His)6，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Rosetta(DE3)宿主菌中，通過(guò)對(duì)表達(dá)條件的優(yōu)化，確定表達(dá)條件為0.175 mMIPTG、14℃、80 rpm誘導(dǎo)14h，重組蛋白以可溶和沉淀兩種形式表達(dá)。采用親和純

3、化得到純度為93％的AKR1B1-(His)6融合蛋白。使用Western blotting蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，蛋白質(zhì)序列分析儀測(cè)定氨基酸序列片段與目的蛋白序列比對(duì)。利用體外酶動(dòng)學(xué)方法測(cè)定AKR1B1-(His)6的比活力為(9.4±0.23) U/mg。使用該蛋白建立醛還原酶抑制劑篩選方法，分別測(cè)定已上市的13種非甾體抗炎藥(Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs，NSAIDs)對(duì)AKR1B1-(His

4、)6的抑制活性。結(jié)果表明，萘普生、雙氯芬酸、氟滅酸、布洛芬等對(duì)融合蛋白AKR1B1-(His)6有較強(qiáng)的抑制作用，可與抗糖尿病并發(fā)癥藥物聯(lián)合用藥。
　　醛還原酶(Aldehyde reductase AKR1A1，EC1.1.1.2)是醛酮還原酶家族成員，能將有毒醛還原成相應(yīng)的醇。為研究非甾體抗炎藥對(duì)AKR1A1的抑制作用，為非甾體抗炎藥的副作用及臨床應(yīng)用提供參考，本研究構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-22b-(His)6-DDDDK-

5、AKR1A1，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Rosetta(DE3)宿主菌中，通過(guò)對(duì)表達(dá)條件的優(yōu)化，確定表達(dá)條件為0.25 mMIPTG、16℃、80 rpm誘導(dǎo)14h，重組蛋白以可溶形式表達(dá)。采用親和純化得到純度為90％的pelB-(His)6-DDDDK-AKR1A1融合蛋白。重組蛋白用腸激酶特異性剪切，經(jīng)過(guò)Ni-NTA、Sephadex G-75再次純化，得到純度為98％的野生型AKR1A1蛋白。使用Western blotting和蛋白質(zhì)序列分

6、析對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。利用體外酶動(dòng)學(xué)方法測(cè)定(His)6-DDDDK-AKR1A1的比活力為(41.3±0.1)U/mg、AKR1A1比活力為(79.4±0.15) U/mg。奧沙普秦、酮基布洛芬、氟滅酸、托芬那酸等對(duì)AKR1A1有很強(qiáng)的抑制作用，為抗炎藥副作用提供參考。
　　為了得到一種具有腦靶向作用的多亞基蛋白質(zhì)，本研究還使用原核共表達(dá)系統(tǒng)，設(shè)計(jì)表達(dá)了一種全新的霍亂毒素類似嵌合蛋白。分別獲得重組質(zhì)粒pET-28a-CTB和pET