1、腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)發(fā)病率最高的原發(fā)性腦腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的40%左右。目前，即使采用手術、放療、化療等綜合治療，腦膠質(zhì)瘤患者的平均五年生存率常不到30%。盡管近十年來，人們在腦膠質(zhì)瘤的基礎與臨床研究方面都取得了很大的進步，但腦膠質(zhì)瘤仍是致殘率、致死率最高的惡性腫瘤之一。其中，作為膠質(zhì)瘤最常見類型之一的膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma，GBM），其平均生存時間更在過去的三十年間無明顯改善。從疾病的發(fā)生、發(fā)展過程來看，腦膠質(zhì)瘤影響患者生活

2、質(zhì)量及導致患者死亡的原因主要來自兩個方面：①腫瘤細胞本身的惡性增殖；②膠質(zhì)瘤細胞作用于宿主并導致患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)多種病理生理變化及多種癥狀與并發(fā)癥的產(chǎn)生。隨著現(xiàn)代分子生物學的發(fā)展，人們在膠質(zhì)瘤細胞惡性增殖分子機制方面取得了很大進展。但是，膠質(zhì)瘤細胞如何引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種病理生理變化？其分子機制如何？這是當前膠質(zhì)瘤研究中的一個薄弱環(huán)節(jié)。 眾所周知，血腦屏障是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)基礎，一般認為，血腦屏障基本結(jié)構(gòu)包括：

3、腦毛細血管內(nèi)皮細胞及其間緊密連接，內(nèi)皮基膜及星形膠質(zhì)細胞終足形成的膠質(zhì)膜。其中，腦毛細血管內(nèi)皮細胞及其間的緊密連接是血腦屏障機能與結(jié)構(gòu)的主要基礎。近年來，隨著緊密連接基礎研究所取得的巨大進步，人們對緊密連接的蛋白組成及其生理功能有了嶄新的認識，目前認為，緊密連接由一組蛋白分子所構(gòu)成的復合體。這些分子包括：①跨膜蛋白，主要由claudins，occludins，junction associated molecules（JAM）等蛋白家族

4、構(gòu)成；②胞漿附屬蛋白，主要由zonula occludens（ZO）等蛋白家族構(gòu)成。細胞膜上這些緊密連接分子元件彼此相互作用并與鄰近細胞膜上緊密連接蛋白相聚合、促使胞膜局部“融合”進而形成冰凍蝕刻電鏡下緊密連接所表現(xiàn)的復雜三維網(wǎng)狀超微結(jié)構(gòu)。血腦屏障結(jié)構(gòu)與功能的完整對維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能至關重要，同時，緊密連接結(jié)構(gòu)與功能的變化也是多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病病理生理變化的核心過程。隨著神經(jīng)腫瘤學的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤細胞可以在其發(fā)生、發(fā)展過程中對

5、血腦屏障產(chǎn)生多種作用進而導致多種神經(jīng)系統(tǒng)癥狀及并發(fā)癥的產(chǎn)生。 關于腦膠質(zhì)瘤中血腦屏障的形態(tài)學改變，許多文獻敘述卻不盡相同。而在膠質(zhì)瘤對血腦屏障緊密連接的影響方面，不同的學者也取得了“開放”與“完整”的不同研究結(jié)果。為了研究膠質(zhì)瘤細胞對血腦屏障的形態(tài)學改變，本研究通過建立腦膠質(zhì)瘤動物模型，探索了膠質(zhì)瘤細胞對血腦屏障的超微結(jié)構(gòu)的影響；同時，隨著現(xiàn)代分子生物學與實驗技術的進步，如何從分子水平上闡明膠質(zhì)瘤細胞對血腦屏障緊密連接的作用及其

6、病理生理意義已成為神經(jīng)腫瘤學研究的當務之急。為了研究腦膠質(zhì)瘤血腦屏障緊密連接主要分子元件的表達變化，從分子水平上闡明膠質(zhì)瘤細胞對血腦屏障緊密連接的影響以及其病理生理意義，本研究利用免疫組化及RT-PCR技術，探索了膠質(zhì)瘤細胞對血腦屏障緊密連接分子元件claudins-5的作用及其可能的分子生物學與病理生理學機制。 目的： 1.建立接近人腦膠質(zhì)瘤的血腦屏障體內(nèi)模型，研究血腦屏障的生理及病理生理變化。 2.研究腦膠質(zhì)

7、瘤血腦屏障緊密連接超微結(jié)構(gòu)的變化，為腦膠質(zhì)瘤中血腦屏障的形態(tài)學改變提供理論基礎。 3.研究腦膠質(zhì)瘤血腦屏障緊密連接主要分子元件的表達變化，從分子水平上闡明膠質(zhì)瘤細胞對血腦屏障緊密連接的影響以及其病理生理意義。 方法： 1.培養(yǎng)C6膠質(zhì)瘤細胞，通過立體定向技術在Wister大鼠右側(cè)尾狀核建立腦膠質(zhì)瘤動物模型； 2.腦膠質(zhì)瘤動物模型建立21天后，通過肉眼和運用MRI檢查腦膠質(zhì)瘤動物模型腫瘤的形成； 3

8、.采用透射電鏡觀察腦膠質(zhì)瘤動物模型及正常Wister大鼠血腦屏障緊密連接的超微結(jié)構(gòu)特征； 4.運用免疫組織化學染色觀察腦膠質(zhì)瘤動物模型及正常Wister大鼠緊密連接蛋白claudin-5的表達： 5.采用半定量RT-PCR的方法探索膠質(zhì)瘤細胞對血腦屏障內(nèi)皮細胞緊密連接蛋白分子元件claudin-5表達的影響。 6.統(tǒng)計學分析：采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包分析。數(shù)據(jù)均以x±s表示，不同部位及正常組claudin-

9、5 mRNA條帶OD值比較采用單向方差分析和多重比較，如果滿足方差齊性采用Fisher方差分析及LSD法進行多重比較，若不滿足方差齊性采用近似F檢驗Welch法方差分析及Tambanes's T2法進行多重比較，以P<0.05為差異有顯著性意義。 結(jié)果： 1.C6腫瘤細胞接種于Wister大鼠右側(cè)尾狀核21天后，肉眼及MRI可見腦膠質(zhì)瘤動物模型右腦形成腫瘤，腫瘤占位效應明顯，腫瘤周邊有局部水腫。 2.透射電鏡下，

10、正常Wister大鼠腦組織微血管相鄰內(nèi)皮細胞間可見連續(xù)條帶狀的緊密連接，細胞間未見裂隙；在腦膠質(zhì)瘤腫瘤中心組織，僅有22.23%微血管相鄰內(nèi)皮細胞間可見條帶狀緊密連接，其余內(nèi)皮細胞間可見明顯裂隙，部分內(nèi)皮細胞間連接為縫隙連接；在腦膠質(zhì)瘤腫瘤邊緣組織中，有57.15%微血管內(nèi)皮細胞間存在緊密連接，其余內(nèi)皮細胞間局部可見裂隙，部分內(nèi)皮細胞間可見縫隙連接。在腦膠質(zhì)瘤腫瘤遠隔部位，有95.65%微血管相鄰內(nèi)皮細胞緊密連接未見破壞，細胞間緊密連接

11、為連續(xù)條帶狀。距腫瘤中心越遠，相鄰微血管內(nèi)皮細胞間緊密連接越完整。 3.膠質(zhì)瘤細胞作用21天后，免疫組織化學染色觀察緊密連接蛋白claudin-5的表達，發(fā)現(xiàn)正常Wister大鼠腦組織微血管內(nèi)皮細胞claudin-5呈強陽性表達，而腫瘤中心組織微血管內(nèi)皮細胞claudin-5表達呈陰性；腫瘤邊緣微血管內(nèi)皮細胞claudin-5呈弱陽性表達。 4.RT-PCR結(jié)果顯示腫瘤邊緣和腫瘤中心claudin-5表達明顯減少，與正常

12、腦組織相比，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000，P=0.000），腫瘤遠隔部位claudin-5表達也減少，但差異無統(tǒng)計學意義（P=0.960）。 結(jié)論： 1.通過立體定向技術可以成功在Wister大鼠右側(cè)尾狀核建立C6腦膠質(zhì)瘤動物模型，并且通過MRI可見腫瘤占位效應明顯，局部形成水腫帶。 2.膠質(zhì)瘤細胞在其發(fā)生、發(fā)展過程中可破壞血腦屏障內(nèi)皮細胞間緊密連接超微結(jié)構(gòu)。 3.在C6腦膠質(zhì)瘤動物模型不同位置的腦組