1、p53基因是一種非常重要的抑癌基因,人類p53基因位于17號(hào)染色體的短臂上(17p13.1),現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)它在細(xì)胞周期調(diào)控、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等方面有重要的作用.p53基因的突變和缺失,是許多腫瘤發(fā)生的重要原因之一.p53基因不僅與腫瘤的發(fā)生有著密切關(guān)系,而且與腫瘤血管調(diào)控、腫瘤細(xì)胞對(duì)放療和化療的敏感性等方面有著重要聯(lián)系.p53基因的這些生物學(xué)效應(yīng)主要通過激活或抑制大量下游基因的表達(dá)來完成,但p53與多種基因之間存在的具體調(diào)節(jié)機(jī)

2、制尚不明確. 在功能基因組研究中,需要對(duì)特定基因進(jìn)行功能喪失或突變.以確定其功能或與其它基因之間的聯(lián)系.RNA干擾(RNA interfererme,RNAi)是近幾年發(fā)展起來的一種特異的靶基因失活技術(shù),它通過小的雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)高效、特異的阻斷體內(nèi)特定基因的表達(dá),促使mRNA降解,誘使細(xì)胞出現(xiàn)缺失特定基因表型的過程.由于RNAi高度的序列專一性,可以特異地使特定基因沉默,在眾多有機(jī)體中,

3、雙鏈RNA能觸發(fā)轉(zhuǎn)錄后基因沉默,因而成為敲除特定基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中表達(dá)的有力工具. 在哺乳動(dòng)物中通過RNAi機(jī)制實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的抑制有多種策略,其中以構(gòu)建siRNA(small intereference RNA)表達(dá)載體的方法最為穩(wěn)定和持久.本研究特異性針對(duì)p53基因來設(shè)計(jì)并構(gòu)建能抑制此基因的RNA干擾載體,把干擾載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入胃癌細(xì)胞SGC-7901,從基因水平和蛋白水平檢測(cè)此干擾載體的抑制效率,并觀察抑制p53基因的表達(dá)

4、對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901的生長(zhǎng)影響.根據(jù)文獻(xiàn)p53SiRNA序列<'[3]>,設(shè)計(jì)并化學(xué)合成2段編碼短發(fā)夾RNA序列的、靶向p53基因的寡核苷酸,退火,克隆到經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶酶切后的siRNA表達(dá)載體--pSIIPER-EGFPl(pSG)啟動(dòng)子的下游,重組構(gòu)建RNAi質(zhì)粒,同時(shí)設(shè)立非特異性對(duì)照,干擾載體用限制性核酸內(nèi)切酶酶切和測(cè)序鑒定,構(gòu)建好的干擾載體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞SGC-7901,用G418篩選建立穩(wěn)定細(xì)胞系,通過RT-PCR和W

5、estern blot檢測(cè)其對(duì)p53基因的抑制效果,并利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)周期和作細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的方法觀察抑制p53基因的表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901的生長(zhǎng)影響. 結(jié)果 經(jīng)HindⅢ和EcoR I雙酶切電泳分析以及插入基因的序列分析證實(shí):我們?cè)O(shè)計(jì)的堿基序列成功插入到了預(yù)計(jì)位點(diǎn),一個(gè)特異性針對(duì)p53基因的干擾載體pSiJPER-EGFPl-p53i(pSG-p53i)構(gòu)建成功.同時(shí),我們也構(gòu)建了一個(gè)非特異性干擾載體p

6、SIJPER-EGFPl-p53c(pSG-p53c)作為對(duì)照. 分別將pSG-p53i和IpSG-p53c轉(zhuǎn)染入胃癌細(xì)胞SGC-7901建立穩(wěn)定細(xì)胞系,用RT-PCR檢測(cè)p53基因mRNA表達(dá)變化,其結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染了pSG-p53i的胃癌細(xì)胞其p53mRNA的表達(dá)水平顯著低于非特異對(duì)照,經(jīng)BandScan V5.0軟件分析得到mRNA表達(dá)的抑制率為62﹪:用Western blot檢測(cè)p53基因蛋白表達(dá)變化,其結(jié)果表明:轉(zhuǎn)染了

7、pSG-p53i的胃癌細(xì)胞其p53基因蛋白表達(dá)量顯著低于非特異對(duì)照. 利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)周期,其結(jié)果為:轉(zhuǎn)染了pSG-p53i的胃癌細(xì)胞相比對(duì)照細(xì)胞其Gl期細(xì)胞減少了24.2﹪,S期細(xì)胞增加了81.0﹪,G2期細(xì)胞減少了77.9﹪.作轉(zhuǎn)染了pSG-p53i的胃癌細(xì)胞和轉(zhuǎn)染了:pSG-p53c的胃癌細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖,生長(zhǎng)曲線圖顯示:與對(duì)照細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染了pSG-p53i細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線發(fā)生了一定程度的左移.成功的構(gòu)建了能