1、近年來，由Barrett食管（Barrett's esophagus，BE）轉(zhuǎn)化而來的食管腺癌的發(fā)病率明顯升高，成為所有惡性腫瘤中增長速度最快的一種。食管腺癌是一種惡性度較高的消化道腫瘤，其侵襲力和轉(zhuǎn)移率較高，許多患者在就診時已處于腫瘤晚期，5年生存率很低。目前與食管腺癌侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)的因子成為當(dāng)前研究重點之一。
　　 表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）通過其細(xì)胞表面的受體（epidermal

2、growth factor receptor，EGFR）即表皮生長因子受體介導(dǎo)發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)。有研究表明：EGF與受體結(jié)合后，通過激發(fā)多條信號傳導(dǎo)通路，將有絲分裂信號傳遞到細(xì)胞核，引起細(xì)胞增殖，同時在細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移中起重要作用。另有研究發(fā)現(xiàn)EGF及其受體EGFR在食管腺癌組織中表達(dá)明顯增高，并與腫瘤的發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。提示EGF可能在刺激食管腺管癌細(xì)胞侵襲，促進(jìn)腫瘤發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。
　　 腫瘤侵襲是一個多階段過程

3、，包括細(xì)胞增殖、黏附、運(yùn)動及各種酶的分泌。在這些環(huán)節(jié)中，細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞基底膜的降解是腫瘤侵襲過程中的關(guān)鍵所在。研究證實，尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator，u-PA）作用系統(tǒng)被認(rèn)為在細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解、促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中起核心作用。其他多種惡性腫瘤（包括肺癌、胰腺癌、胃癌、直結(jié)腸癌、前列腺癌等）研究中發(fā)現(xiàn)u-PA的激活與腫瘤侵襲力有關(guān)?，F(xiàn)已證實體內(nèi)多種因子如TGF

4、、IGF、EGF、KGF、IL-1等均能調(diào)控u-PA表達(dá)，但迄今為止對其表達(dá)的分子調(diào)控機(jī)制研究較少。
　　 EGF與其受體結(jié)合后誘導(dǎo)MAPK的磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，是EGF誘導(dǎo)的重要反應(yīng)。p38是MAPK家族中的一員，是一組細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，p38MAPK上游的MAPKK通過磷酸化p38MAPK的Thr-Gly-Tyr位點中的蘇氨酸和酪氨酸使其活化，活化的p38MAPK進(jìn)一步調(diào)控下游多種基因的表達(dá)，參與調(diào)控炎癥、細(xì)胞生長、細(xì)胞分化，

5、細(xì)胞周期及細(xì)胞死亡、侵襲表型等。近年來研究發(fā)現(xiàn)，p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與胃癌、肺癌、淋巴瘤及乳腺癌等細(xì)胞u-PA的表達(dá)調(diào)控。目前尚未見關(guān)于p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與食管腺癌SEG-1細(xì)咆侵襲關(guān)系的相關(guān)報道。
　　 為此，本研究從EGF著手，通過對p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的特異性阻斷，觀察阻斷前后p38MAPK蛋白、u-PA表達(dá)變化，研究p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在EGF誘導(dǎo)SFG-1細(xì)胞表達(dá)u-PA中的作用，探討食管腺

6、癌細(xì)胞侵袋機(jī)制。
　　 目的：探討EGF通過p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)SEG-1細(xì)胞表達(dá)u-PA促進(jìn)腫瘤侵襲的機(jī)制。
　　 方法：采用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)食管腺癌SEG-1細(xì)胞，以相同濃度的EGF（100ng/ml）按時間梯度刺激SEG-1細(xì)胞，應(yīng)用Western blot法測定各時間點總p38MAPK蛋白、磷酸化p38MAPK蛋白、u-PA蛋白表達(dá)，應(yīng)用RT-PCR方法檢測各時間點u-PA mRNA表達(dá)。用p38M

7、APK特異抑制劑SB203580預(yù)處理細(xì)胞后，觀察上述指標(biāo)變化。
　　 結(jié)果：①EGF對SEG-1細(xì)胞p38MAPK蛋白表達(dá)的影響：應(yīng)用Westem blot方法檢測p38MAPK蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示大約在43KD位置出現(xiàn)p-p38MAPK特異性條帶，在38KD位置出現(xiàn)t-p38MAPK特異性條帶。EGF作用于SEG-1細(xì)胞后p38MAPK磷酸化程度有所升高，磷酸化程度隨EGF作用時間的變化而變化：1h，6h，12h，24h，48

8、h的p38MAPK磷酸化的百分比分別為11.2％，26.4％，37.6％，55.2％，41.1％。可見24h的p38MAPK磷酸化水平最高，因此認(rèn)為該時間點為p38MAPK最高大磷酸化時間點。②EGF對SEG-1細(xì)胞u-PA mRNA和蛋白表達(dá)的影響：應(yīng)用RT-PCR方法檢測u-PA mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示人食管腺癌細(xì)胞（SEG-1）中有u-PA基因表達(dá)，隨著EGF作用時間的延長，u-PA mRNA的表達(dá)水平逐漸上升：EGF作用于SEG

9、-1細(xì)胞1h后u-PAmRNA表達(dá)為：0.265±0.057，與對照組（0.259±0.064）相比，p>0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義；EGF作用于SEG-1細(xì)胞6h后，u-PAmRNA表達(dá)為0.306±0.061，與對照組（0.259±0.064）相比，u-PAmRNA表達(dá)升高，有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；EGF作用于SEG-1細(xì)胞12h、24h、48h后u-PA mRNA分別表達(dá)為：0.642±0.049，0.894±0.045，0.7

10、25±0.051，與對照組（0.259±0.064）相比，u-PAmRNA表達(dá)明顯升高，有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.01）?？梢姳緦嶒炛衭-PA mRNA表達(dá)隨EGF作用時間逐漸升高，于24h達(dá)高峰，后又逐漸下降。Westem blot方法檢測u-PA蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示EGF刺激前SEG-1細(xì)胞u-PA蛋白表達(dá)量較低，刺激后6h開始上升，持續(xù)至24h達(dá)最高，后又逐漸下降，呈明顯的時間依賴性。EGF作用于SEG-1細(xì)胞1h后u-PA蛋白表達(dá)為0

11、.291±0.063，與對照組（0.288±0.036）比較，p>0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義。作用6h后u-PA蛋白表達(dá)為0.458±0.069與對照組（0.288±0.036）比較，表達(dá)升高，p<0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義。作用12h、24h、48h后，u-PA蛋白表達(dá)為0.705±0.056、0.0845±0.049、0.756±0.042，與對照組（0.288±0.036、）比較，表達(dá)明顯升高，p<0.01，有統(tǒng)計學(xué)意義。③p38MAPK

12、特異抑制劑SB203580可明顯抑制EGF誘導(dǎo)的p38MAPK激酶活力，對EGF誘導(dǎo)的SEG-1細(xì)胞內(nèi)u-PA mRNA和蛋白的表達(dá)亦有明顯的抑制作用。5μmol/L、10μmol/L、20μmol/LSB203580與EGF同時作用與細(xì)胞后p38MAPK磷酸化的百分比分別為36.2％，19.3％，7.1％，明顯低于EGF組p38MAPK磷酸化的百分值51.4％。SB203580（5μmol/L）+EGF組、SB203580（10μmo

13、l/L）+EGF組u-PA mRNA表達(dá)分別為0.718±0.029，0.607±0.047，與EGF組0.853±0.034相比，p<0.05，表達(dá)下降，有統(tǒng)計學(xué)意義。EGF+SB203580（20μmol/L）組表達(dá)量為0.313±0.034與EGF組0.853±0.034相比，p<0.01，表達(dá)明顯下降，有統(tǒng)計學(xué)意義SB203580（5μmol/L）+EGF組、SB203580（10μmol/L）+EGF組u-PA蛋白表達(dá)分別為0

14、.708±0.048，0.654±0.052，與EGF組0.805±0.042相比，p<0.05，表達(dá)下降，有統(tǒng)計學(xué)意義。SB203580（20μmol/L）+EGF組表達(dá)量為0.303±0.045與EGF組0.805±0.042相比，p<0.01，表達(dá)明顯下降，有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論：①EGF可引起p38MAPK蛋白磷酸化，在相同濃度EGF（100ng/ml）作用下，p38MAPK蛋白的磷酸化呈時間依賴性，最大磷酸化的作用