1、本研究擬克隆人磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白4(humanphosphatidylethanolamine(PE)-bindignprotein4，hPEBP4)的小鼠同源分子mPEBP4，并對其生物學功能進行初步研究。主要內(nèi)容如下： 第一部分、mPEBP4的克隆和序列分析、組織細胞分布和細胞定位研究。 PEBP是一類能與磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合的蛋白，該家族的所有成員都含有與PE結(jié)合的保守區(qū)域(PBP)。人磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白4

2、(humanphosphatidylethanolamine(PE)-bindingprotein4，hPEBP4)是我們從人骨髓基質(zhì)細胞(BMSC)cDNA文庫中自主發(fā)現(xiàn)的一種新型PEBP家族成員，其全長cDNA為874bp，編碼227氨基酸的蛋白。我們以往的研究表明該蛋白在核酸和氨基酸水平上與人磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白高度同源，含有PBP保守區(qū)域。以前我們通過免疫組化已證實hPEBP4在人乳腺癌組織高表達，而在正常人乳腺組織不表達；功能

3、研究發(fā)現(xiàn)，hPEBP4表達下調(diào)后能夠促進TNF-a誘導的MCF-7乳腺癌細胞凋亡。由于我們以前的結(jié)果證實hPEBP4選擇性表達于乳腺癌腫瘤組織，而hPEBP4表達下調(diào)增強了乳腺癌腫瘤細胞對TNF-a誘導凋亡的敏感性，提示hPEBP4很可能是治療乳腺癌的一個新的作用靶點。在我們以往工作的基礎(chǔ)上，我們擬尋找hPEBP4的小鼠同源分子，因此，我們用hPEBP4進行Blast，搜索到結(jié)構(gòu)特征與hPEBP4非常相似的小鼠未命名的PEBP樣蛋白(B

4、AB24810)，并克隆了該全長新基因，將其命名為小鼠PEBP4(mPEBP4)。對其核酸及預(yù)期蛋白序列進行結(jié)構(gòu)分析顯示，mPEBP4cDNA全長1048bp，編碼242個氨基酸。其氨基酸序列在106-213位為磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合保守區(qū)域(PBP)。mPEBP4基因定位于小鼠的14號染色體的14D1區(qū)域。該序列已經(jīng)在GenBank/EMBL數(shù)據(jù)庫登陸，序列號為AK006964。 同源比較和多肽結(jié)構(gòu)分析顯示，mPEBP4蛋白

5、在106到213位為磷脂酰乙醇胺結(jié)合保守區(qū)域。Pro119、Asp120、Pro122、His134和Arg171為PEBP家族中的保守氨基酸，涉及到?jīng)Q定PEBPs配體結(jié)合位點的基本結(jié)構(gòu)。氨基酸殘基(113-139)和(163-175)為PEBP4s家族中兩個主要的高度保守區(qū)域。氨基酸殘基113-123(包括cisPro122)組成結(jié)合區(qū)的邊緣。118-120和第122殘基形成的Asp-Pro-Asp-x-Promotif基序為該家族所

6、有成員都含有的保守序列。Asp118和His134存在于結(jié)合口袋的底部。168-171殘基是第二個高度保守區(qū)域，由Arg171和Gly-x-His-Arg殘基組成。163-175之間的保守區(qū)域形成結(jié)合口袋另一邊。mPEBP4的這些結(jié)構(gòu)特征提示mPEBP4含有PE結(jié)合保守區(qū)域。 RT-PCR分析結(jié)果顯示，mPEBP4mRNA在小鼠組織中的表達比較特異，僅特定地表達于小鼠的眼組織，而在其它組織如骨髓、子宮、前列腺、平滑肌、胃、全腦、

7、海馬、肝等均不表達(因此，我們根據(jù)組織表達譜從小鼠眼cDNA中克隆了mPEBP4的全長基因)。同時，我們發(fā)現(xiàn)mPEBP4mRNA除了在小鼠成纖維細胞NIH3T3上有弱表達外，在其它多種培養(yǎng)細胞系中均不表達。小鼠乳腺癌細胞4T1不表達mPEBP4，用表阿霉素(1μg/ml)刺激后，mPEBP4在12小時開始表達，24小時達到高峰；而用TNF-a(50ng/ml)和TRAIL(100ng/ml)刺激4T1細胞仍不能誘導mPEBP4的表達。這

8、表明mPEBP4可能與我們以往研究的hPEBP4的功能不同，可能并不參與TNF-a或TRAIL誘導的細胞凋亡信號轉(zhuǎn)錄通路，而可能參與抵抗表阿霉素所引起的細胞損傷。Confocal顯微鏡分析結(jié)果顯示，mPEBP4分子與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/高爾基體部分共定位，而與線粒體、溶酶體不發(fā)生共定位。 第二部分、mPEBP4的生物學功能研究及機制探討。 腫瘤轉(zhuǎn)移是導致許多腫瘤患者死亡的主要原因，而腫瘤轉(zhuǎn)移是個復(fù)雜的過程，包括細胞遷移、血管生成、腫

9、瘤細胞與微環(huán)境相互作用以及侵襲到血液或淋巴管，進而在遠處生成轉(zhuǎn)移灶。mPEBP4含有PE結(jié)合保守區(qū)域，屬于PEBP家族，而有研究表明PEBP家族的成員RKIP(Rafkinaseinhibitorprotein，Raf激酶抑制蛋白)能影響腫瘤的轉(zhuǎn)移。所以我們選擇了易轉(zhuǎn)移的小鼠乳腺癌細胞4T1細胞來研究mPEBP4對細胞遷移及侵襲的影響。將野生型、穩(wěn)定表達mPEBP4和空載體的4T1細胞分別行劃痕實驗和Transwell檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)mP

10、EBP4能明顯促進4T1細胞的遷移和侵襲。然后進一步研究了mPEBP4促進4T1細胞遷移和侵襲的機制。已知MAPK信號通路和PKB/Akt信號通路是許多上游信號通路匯合的位置，參與調(diào)節(jié)細胞的代謝、凋亡和增殖等多種功能，研究表明它們與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移也存在著密切的聯(lián)系。所以檢測了MAPK和PI3K-Atk信號通路的活化情況，發(fā)現(xiàn)mPEBP4能抑制血清誘導的ERK1/2和JNK的活化，但不影響p38和Akt的活化。同時還檢測了一些與遷移相關(guān)分

11、子的表達情況，顯示mPEBP4能促進COX-2表達增加，而對TGF-β、MMP-3、MMP-9、CXCR4、CCR7等不產(chǎn)生影響。以上結(jié)果提示，mPEBP4可能通過抑制ERK1/2和JNK的活化以及增加COX-2的表達來促進細胞的遷移和侵襲。 由于前期的研究發(fā)現(xiàn)與mPEBP4結(jié)構(gòu)特征相似的分子hPEBP4具有抗凋亡作用，所以研究了其在凋亡方面的作用。表阿霉素(Epirubicin)是乳腺癌化療中最常用的藥物，無論在乳腺癌術(shù)前新輔

12、助治療、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移解救治療和早期乳腺癌術(shù)后輔助治療中都占有非常重要的位置。因此我們選擇了表阿霉素作為4T1細胞的凋亡誘導劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定表達mPEBP4的4T1細胞能抑制表阿霉素誘導的細胞凋亡。MAPK信號通路活化對于凋亡進程的影響非常復(fù)雜，在不同的細胞和不同的刺激環(huán)境下產(chǎn)生不同的效應(yīng)，所以我們檢測了MAPK信號通路的活化情況。結(jié)果顯示mPEBP4能促進表阿霉素誘導的ERK1/2和JNK的活化，但不影響p38的活化。但mPEBP4抑制表

13、阿霉素誘導細胞凋亡的確切機制還不清楚，有待于進一步研究探討。 綜上所述，采用hPEBP4進行Blast，搜索到結(jié)構(gòu)特征與hPEBP4非常相似的小鼠未命名的PEBP樣蛋白(BAB24810)，其106到213位蛋白序列為磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，將該全長新基因命名為mPEBP4，并從小鼠眼cDNA中克隆了該分子的全長基因。mPEBP4僅特異地表達于小鼠的眼組織，且除了在小鼠成纖維細胞NIH3T3上有弱表達外，在其它多種培養(yǎng)細

14、胞系中均不表達。Confocal顯微鏡發(fā)現(xiàn)mPEBP4分子與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/高爾基體部分共定位。mPEBP4能增強小鼠乳腺癌細胞4T1的遷移和侵襲能力，并能抑制血清誘導的ERK1/2和JNK的活化及引起COX-2的表達增加。mPEBP4能抑制表阿霉素誘導的4T1細胞凋亡，并能促進表阿霉素誘導的ERK1/2和JNK的活化。mPEBP4促進細胞遷移和侵襲以及抑制表阿霉素誘導的細胞凋亡的這些作用，提示其很可能作為腫瘤治療的靶點，可以通過干擾mPEBP