1、背景
　　昆蟲(chóng)高度復(fù)雜而靈敏的嗅覺(jué)系統(tǒng)用于識(shí)別環(huán)境中特異的化學(xué)氣味分子。嗅覺(jué)在昆蟲(chóng)的覓食、寄主定位、尋偶、產(chǎn)卵等方面發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。對(duì)嗅覺(jué)分子機(jī)制的研究揭示了氣味受體介導(dǎo)的氣味分子與嗅覺(jué)神經(jīng)元的專(zhuān)一性結(jié)合是昆蟲(chóng)嗅覺(jué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要生理學(xué)基礎(chǔ)。每個(gè)昆蟲(chóng)嗅覺(jué)神經(jīng)元通常表達(dá)兩種氣味受體:傳統(tǒng)氣味受體和嗅覺(jué)共同受體Orco（之前被稱(chēng)為Or83b）。每種昆蟲(chóng)只有一種Orco受體基因，且都為果蠅Orco的直系同源基因(ortholog)

2、。各種昆蟲(chóng)的Orco組成了Orco受體家族（Orco family）。Orco通過(guò)異源二聚化與傳統(tǒng)氣味受體形成一個(gè)具有氣味識(shí)別能力的復(fù)合體。Orco受體的主要功能是將傳統(tǒng)氣味受體運(yùn)送至嗅覺(jué)神經(jīng)元樹(shù)突膜的表面，同時(shí)維持嗅覺(jué)受體復(fù)合體的構(gòu)象穩(wěn)定。對(duì)該受體基因的突變可以導(dǎo)致昆蟲(chóng)嗅覺(jué)功能的嚴(yán)重缺失。因此，有望以O(shè)rco受體作為潛在的分子靶標(biāo)設(shè)計(jì)和發(fā)展新的害蟲(chóng)治理策略。
　　絲光綠蠅Lucilia sericata Meigen和大頭金蠅C

3、hrysomyamegacephala Fabricius，屬于雙翅目Diptera麗蠅科Calliphoridae，是兩種重要的醫(yī)學(xué)媒介昆蟲(chóng)。成蟲(chóng)能機(jī)械性傳播多種病原體，危害人類(lèi)健康。幼蟲(chóng)作為兼性體外寄生蟲(chóng)可以引起蠅蛆病，對(duì)畜牧業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)于麗蠅嗅覺(jué)系統(tǒng)的研究先前主要集中在形態(tài)學(xué)、電生理學(xué)、行為學(xué)和化學(xué)生態(tài)學(xué)等方面，尚未開(kāi)展有關(guān)嗅覺(jué)分子機(jī)制的研究。
　　目的
　　探究麗蠅嗅覺(jué)識(shí)別的分子基礎(chǔ)，克隆氣味受體基因并鑒

4、定其功能，為更有效的利用嗅覺(jué)系統(tǒng)進(jìn)行麗蠅綜合治理提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。
　　方法
　　1.采用RT-PCR方法和RACE策略克隆絲光綠蠅和大頭金蠅Orco基因的全長(zhǎng)序列。利用多種生物信息學(xué)軟件分析新獲得基因的核酸序列，預(yù)測(cè)其推導(dǎo)氨基酸序列的結(jié)構(gòu)特征。
　　2.使用半定量RT-PCR方法檢測(cè)絲光綠蠅和大頭金蠅Orco基因在成蟲(chóng)觸角、下顎須、胸部、腹部、足部及產(chǎn)卵器中的表達(dá)情況。
　　3.應(yīng)用原位雜交技術(shù)檢測(cè)大頭金

5、蠅Orco基因的mRNA在觸角和下顎須中的分布情況。
　　4.采用熒光定量PCR方法檢測(cè)絲光綠蠅Orco基因在卵、幼蟲(chóng)、蛹及成蟲(chóng)四個(gè)發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)水平。
　　5.為鑒定麗蠅Orco基因的功能，利用RNA干擾技術(shù)沉默大頭金蠅Orco基因的表達(dá)，通過(guò)Y型嗅覺(jué)儀驗(yàn)證大頭金蠅對(duì)食物氣味趨化性行為反應(yīng)。
　　結(jié)果
　　1.克隆得到絲光綠蠅和大頭金蠅Orco基因的全長(zhǎng)序列，分別命名為L(zhǎng)serOrco（GenBank登錄號(hào)

6、:HQ315862）和CmegOrco（GenBank登錄號(hào):HQ315861）。LserOrco和CmegOrco的開(kāi)放讀碼框都為1437bp，編碼478個(gè)氨基酸殘基。兩條基因推導(dǎo)的蛋白序列不僅彼此間具有98％的同一性，并且與先前報(bào)道的其他昆蟲(chóng)的同源受體之間具有高度的序列保守性。組成蛋白C末端的164個(gè)氨基酸為序列的極端保守區(qū)，氨基酸的同一性接近90％。LserOrco和CmegOrco的蛋白序列被預(yù)測(cè)都包含7個(gè)跨膜區(qū)，膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與其

7、他昆蟲(chóng)Orco蛋白相同，跨膜方式為受體蛋白的N末端位于膜內(nèi)C末端位于膜外。
　　2.LserOrco和CmegOrco在雌性和雄性的觸角及下顎須中呈強(qiáng)表達(dá)，在雌性的產(chǎn)卵器中存在微弱表達(dá);在其他非嗅覺(jué)組織中表達(dá)模式有所差別，LserOrco在雌性和雄性的足部有少量表達(dá)，在胸部和腹部無(wú)表達(dá)，而CmegOrco在雌性和雄性的腹部有少量表達(dá)，在胸部和足部無(wú)表達(dá)。
　　3.CmegOrco基因的mRNA在雌性和雄性的大部分嗅覺(jué)神經(jīng)元中

8、都有表達(dá)。在觸角第3節(jié)（鞭節(jié)）和下顎須的末端膨大處被探針標(biāo)記的陽(yáng)性嗅覺(jué)神經(jīng)元呈廣泛性分布，而在觸角第1節(jié)（柄節(jié)）呈零星分布。
　　4.LserOrco在卵、幼蟲(chóng)及成蟲(chóng)三個(gè)階段都有表達(dá)，而在蛹的早期（蛹?xì)ば纬珊?6 hr左右）未見(jiàn)到表達(dá)。卵期相對(duì)表達(dá)量最低。在幼蟲(chóng)期，LserOrco的相對(duì)表達(dá)量從1齡期到2齡期逐漸增加，到3齡期開(kāi)始下降。LserOrco在成蟲(chóng)嗅覺(jué)組織的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于卵和幼蟲(chóng)階段的組織。其中，LserOrco在雌蠅

9、觸角中的相對(duì)表達(dá)量是卵的413倍。
　　5.對(duì)CmegOrco基因?qū)嵤㏑NA干擾后的24 hr、48 hr和72 hr，使用RT-PCR對(duì)dsRNA注射組、無(wú)RNase水注射組與未注射組CmegOrco基因的mRNA進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，與無(wú)RNase水注射組和未注射組相比，dsRNA注射組CmegOrco基因的表達(dá)量在48 hr和72 hr明顯降低，說(shuō)明隨著時(shí)間增加，dsRNA對(duì)嗅覺(jué)器官中CmegOrco基因的表達(dá)起到了明顯的抑制

10、作用。無(wú)RNase水注射組與未注射組CmegOrco轉(zhuǎn)錄本的條帶強(qiáng)度十分接近，說(shuō)明無(wú)RNase水對(duì)CmegOrco基因表達(dá)沒(méi)有影響。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示，在假設(shè)大頭金蠅對(duì)食物源和對(duì)照品的選擇率相等（即H0）的前提下，未注射組（野生型）成蟲(chóng)被腐敗豬肝產(chǎn)生的氣味強(qiáng)烈吸引(x2=16.634，df=1，p=0.000);同樣，注射無(wú)RNase水的成蟲(chóng)對(duì)腐敗豬肝產(chǎn)生的氣味具有顯著的趨向性(x2=12.281，df=1，p=0.000)。然而，注射ds

11、RNA的成蟲(chóng)對(duì)食物氣味的敏感性明顯減弱，在腐敗豬肝與對(duì)照品的選擇上呈隨機(jī)分布(x2=0.048，df=1，p=0.827)，接受Ho，表明dsRNA沉默了CmegOrco基因的表達(dá)，從而顯著損害了大頭金蠅的嗅覺(jué)能力。
　　結(jié)論
　　1.首次從兩種媒介昆蟲(chóng)絲光綠蠅和大頭金蠅中克隆出氣味受體基因。
　　2.LserOrco和CmegOrco是果蠅Orco的直系同源基因，與Orco家族中的其他成員具有極為相似的結(jié)構(gòu)特征和表達(dá)