1、目的與背景 慢性腦缺血是血管性癡呆(vascular dementia，VD)和阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)發(fā)病的重要基礎(chǔ)。近來研究證明，AD和VD均存在明顯的血管因素，而腦血流低灌注在癡呆的發(fā)病進程中的作用日益引起重視，因此研究其發(fā)病機制對慢性腦缺血相關(guān)性疾病的臨床防治具有普遍意義。 慢性腦缺血所致的神經(jīng)損傷主要表現(xiàn)為學習和記憶等認知功能損害。海馬缺血性損傷是其主要的病理基礎(chǔ)。慢性腦缺血

2、導致海馬功能改變包含兩個主要方面的作用：神經(jīng)細胞的損傷和延遲性膽堿能功能的缺損。中樞膽堿能神經(jīng)有促進學習記憶、激活腦電、維持覺醒、參與精神意志活動等重要生理功能。膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(choline acetyltransferase，Chat)常作為研究膽堿能神經(jīng)元的特殊標志。丁基苯酞(dl-n-butylphthalide,NBP)是治療腦缺血的一種新藥。有研究表明NBP可改善小鼠全腦缺血腦能量代謝，增加局部腦缺血大鼠缺血區(qū)的腦血流，改善

3、大腦中動脈結(jié)扎(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠學習記憶障礙。本文通過免疫組化、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(Reverse Transcriptase Polymerse Chain Rection，RT-PCR)、斑點免疫結(jié)合實驗三種方法觀察大鼠海馬區(qū)Chat的變化，旨在探討NBP對慢性缺血引起的認知功能障礙的影響及其作用機制。 材料方法 1．實驗動物與分組健康Wistar大鼠

4、150只，隨機分為5組，每組30只，A組：對照組(假手術(shù)+溶劑)；B組：單純?nèi)毖M(手術(shù)+溶劑)；C組：缺血低劑量治療組(手術(shù)+低劑量NBP+溶劑)；D組：缺血高劑量治療組(手術(shù)+高劑量NBP+溶劑)；E組：預防組(中等劑量NBP+溶劑+手術(shù))。 2．模型的制作鈍性分離單純?nèi)毖M和缺血高、低劑量治療組大鼠雙側(cè)頸總動脈，用O號手術(shù)線分別結(jié)扎其近心端及遠心端；分離對照組雙側(cè)頸總動脈但不結(jié)扎。 3．標本的制作手術(shù)3月后，所有大鼠經(jīng)心臟

5、灌注后，斷頭取腦，部分用4％的多聚甲醛固定后做石蠟切片，供做免疫組化用；部分放入超低溫冰箱，以備RT-PCR及免疫斑點表達。 4．實驗室檢測方法應用免疫組化、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應、斑點免疫結(jié)合實驗等技術(shù)。 5．統(tǒng)計學方法應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件(SPSS Inc)進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布且方差齊，不同組之間的計量資料的比較應用單因素方差分析，否則用非參數(shù)檢驗。檢驗水準α=0.05。 結(jié)果 1．實

6、驗動物一般情況術(shù)后大鼠均出現(xiàn)精神萎靡，反應遲鈍，進食減少。術(shù)后1天，A組精神恢復；B、C、D、E組改善不明顯。3-5天B、C、D、E組逐漸恢復，1周后反應、進食正常。 2．Chat免疫組化染色各組海馬區(qū)Chat陽性神經(jīng)元數(shù)目進行觀察并統(tǒng)計：B組與A組相比，Chat的表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；C組、D組、E組與B組相比Chat的表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；D組與C組、E組相比Chat表達增

7、加，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。E組與C組差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 3．ChatmRNART-PCR的結(jié)果各組海馬區(qū)ChatmRNA光密度值與ActinmRNAY匕密度值的比值進行觀察并統(tǒng)計：B組與A組相比，Chat的表達明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)； C組、D組、E組與B組相比Chat的表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；D組與C組、E組相比Chat表達增加，且差異具

8、有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；E組與C組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 4．Chat斑點免疫結(jié)合實驗的結(jié)果各組海馬區(qū)Chat免疫斑點的灰度值進行觀察并統(tǒng)計：B組與A組相比，Chat的表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；C組、D組、E組與B組相比Chat的表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；D組與C組、E組相比Chat表達增加，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。E組與C組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。