1、目的：丁苯酞為我國(guó)自主研發(fā)的國(guó)家Ⅰ類新藥，其具有改善局部腦缺血大鼠模型腦梗塞和記憶減退的作用，并能降低腦缺血性腦水腫，改善全腦缺血小鼠腦能量代謝的作用。但是口服的肝臟毒性作用點(diǎn)尚不了解。要鑒定丁苯酞早期肝臟癥狀難度較大，因?yàn)閷?duì)丁苯酞肝臟作用的發(fā)生、發(fā)展表現(xiàn)形式了解不夠詳盡。臨床上作用的癥狀與肝功能下降程度不平行。由于對(duì)丁苯酞肝臟作用發(fā)生的作用點(diǎn)及分子機(jī)制知之甚少，故預(yù)防和藥物治療方向了解不夠，目前尚缺乏明確的治療措施。丁苯酞早期肝臟作用

2、研究目前處在個(gè)別分子基因水平終點(diǎn)上，而高通量、多終點(diǎn)基因芯片技術(shù)將為尋找暴露低于臨床中毒癥狀劑量的丁苯酞肝臟作用機(jī)制提供研究平臺(tái)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖怯^察丁苯酞對(duì)大鼠口服10天以及停藥10天后肝臟的差異基因表達(dá)情況，為丁苯酞毒性分子機(jī)制研究及制定中毒治療方案提供科學(xué)依據(jù)。
　　 方法：⑴將丁苯肽以不同劑量給大鼠口服灌藥，作為實(shí)驗(yàn)組，灌服自來水大鼠為對(duì)照組。灌藥后在不同時(shí)間點(diǎn)如，3天、10天、20天，10+10天將動(dòng)物處死，取肝臟組織及其

3、它臟器-70℃冰箱保存?zhèn)溆?。⑵按照一步法提取不同?shí)驗(yàn)組及對(duì)照組大鼠肝臟的RNA，參照Schena方法逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記cDNA探針并純化。用Cy3-dCTP熒光標(biāo)記對(duì)照組樣本，Cy5-dCTP熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)組樣本，乙醇沉淀后將探針混合，溶于雜交液中。表達(dá)譜芯片由北京博奧生物芯片有限公司提供，芯片類型BiostarR-40s，大鼠芯片，該型芯片包含4094靶基因。⑶將預(yù)雜交的基因芯片和待雜交的探針分別在95℃水浴中變性30 s和2 min，將探針加

4、在芯片上，于雜交箱內(nèi)42℃雜交過夜（15-18 hrs）。洗滌，晾干。⑷將雜交好的玻片浸入裝有洗滌液的染色缸中洗滌10 min，沖洗，晾干后掃描。⑸用掃描儀對(duì)芯片進(jìn)行掃描，獲取基因表達(dá)的熒光信號(hào)強(qiáng)度值。用圖像處理軟件對(duì)雜交的芯片掃描圖像進(jìn)行數(shù)字化處理，計(jì)算Cy3和Cy5兩種熒光信號(hào)的強(qiáng)度和比值，通過比值的范圍確定有差異表達(dá)的基因，并分析差異基因的種類。
　　 結(jié)果：①正常劑量（60mg/kg天）用藥3天，可見AY387051（1

5、1-β-羥類固醇脫氫酶），BC089765（p450酶2家系a亞科多肽2），x79991（p450酶2家系a亞科多肽18）皆呈上調(diào)變化，其上調(diào)的幅度不大。而X63545（p450酶2家系b亞科多肽12）沒有受到影響，未產(chǎn)生基因的變化。②正常劑量（60mg/kg·天）給藥10天，AY387051（11-β-羥類固醇脫氫酶）基因產(chǎn)生繼續(xù)上調(diào)，其上調(diào)的幅度大于正常劑量三天組，BC089765（p450酶2家系a亞科多肽2），x79991（p4

6、50酶2家系a亞科多肽18）皆呈上調(diào)變化且上調(diào)幅度稍大與上組。X63545（p450酶2家系b亞科多肽12）而沒有受到影響，未產(chǎn)生基因的變化。③正常劑量（60mg/kg·天）給藥20天，可見AY387051（11-β-羥類固醇脫氫酶），BC089765（p450酶2家系a亞科多肽2），x79991（p450酶2家系a亞科多肽18），X63545（p450酶2家系b亞科多肽12）皆產(chǎn)生上調(diào)的變化。AY387051（11-β-羥類固醇脫氫酶

7、）的上調(diào)幅度較前兩組皆幅度加大。④正常劑量（60mg/kg·天）服藥10天停藥10天，AY387051（11-β-羥類固醇脫氫酶）還是呈上調(diào)的變化。而BC089765（p450酶2家系a亞科多肽2），x79991（p450酶2家系a亞科多肽18）皆恢復(fù)正常。證明10天停藥后該藥物對(duì)AY387051（11-β-羥類固醇脫氫酶）仍有持續(xù)影響，而對(duì)BC089765（p450酶2家系a亞科多肽2），x79991（p450酶2家系a亞科多肽18）

8、的影響則消失。同時(shí)可見X63545（p450酶2家系b亞科多肽12）呈下調(diào)變化。⑤高劑量（120mg/kg·天）給藥3天基因變化情況。所有四個(gè)基因AY387051（11-β-羥類固醇脫氫酶），BC089765（p450酶2家系a亞科多肽2），x79991（p450酶2家系a亞科多肽18），X63545（p450酶2家系b亞科多肽12）皆成上調(diào)變化。其上調(diào)幅度皆大于正常劑量三天組。證明了藥物劑量的增加對(duì)于這幾個(gè)基因的影響作用亦增加。⑥高劑

9、量（120mg/kg·天）給藥10天基因變化情況。AY387051（11-β-羥類固醇脫氫酶），BC089765（p450酶2家系a亞科多肽2），x79991（p450酶2家系a亞科多肽18）皆繼續(xù)呈上調(diào)，而X63545（p450酶2家系b亞科多肽12）恢復(fù)正常。與一倍劑量組相比，Y387051（11-β-羥類固醇脫氫酶），BC089765（p450酶2家系a亞科多肽2），x79991（p450酶2家系a亞科多肽18）的上調(diào)程度有所增加

10、。⑦高劑量（120mg/kg·天）給藥20天基因變化情況。AY387051（11-β-羥類固醇脫氫酶），BC089765（p450酶2家系a亞科多肽2），x79991（p450酶2家系a亞科多肽18），X63545（p450酶2家系b亞科多肽12）皆呈上調(diào)變化。其中X63545（p450酶2家系b亞科多肽12）的上調(diào)幅度較正常劑量20天時(shí)明顯增加。⑧高劑量（120mg/kg·天）給藥10天停藥10天的基因變化情況。AY387051（11

11、-β-羥類固醇脫氫酶）繼續(xù)成上調(diào)變化。而其他三個(gè)基因BC089765（p450酶2家系a亞科多肽2），x79991（p450酶2家系a亞科多肽18），X63545（p450酶2家系b亞科多肽12）則恢復(fù)正常?？梢妼?duì)于AY387051（11-β-羥類固醇脫氫酶）藥物的影響較其他三個(gè)基因持續(xù)，且不易恢復(fù)。⑨四倍劑量組（240mg/kg·天）給藥3天基因變化情況。所有四個(gè)基因AY387051（11-β-羥類固醇脫氫酶），BC089765（p4

12、50酶2家系a亞科多肽2），x79991（p450酶2家系a亞科多肽18）， X63545（p450酶2家系b亞科多肽12）皆產(chǎn)生上調(diào)的變化。而其中X63545（p450酶2家系b亞科多肽12）的上調(diào)幅度很大。與前給藥相比，高劑量初始對(duì)于X63545（p450酶2家系b亞科多肽12）的影響大于對(duì)于其他三個(gè)基因。⑩四倍劑量組（240mg/kg·天）給藥10天基因變化情況。所有四個(gè)基因AY387051（11-β-羥類固醇脫氫酶），BC089

13、765（p450酶2家系a亞科多肽2），x79991（p450酶2家系a亞科多肽18），X63545（p450酶2家系b亞科多肽12）皆產(chǎn)生上調(diào)的變化。其中AY387051（11-β-羥類固醇脫氫酶）的上調(diào)幅度明顯加大，而X63545（p450酶2家系b亞科多肽12）上調(diào)幅度有所降低。
　　 結(jié)論：丁苯肽大鼠灌胃研究大鼠肝內(nèi)4094個(gè)基因變化，其中一些基因m RNA發(fā)生變化，不同劑量丁苯肽作用下基因mRNA發(fā)生變化也不同。其中有