1、植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑(CYS)是在植物體內(nèi)能可逆地抑制半胱氨酸蛋白酶活性的一類(lèi)蛋白家族。CYS基因已在擬南芥、水稻、大豆等多種植物中被鑒定，并揭示了該類(lèi)基因在不同物種中的結(jié)構(gòu)特征和生物學(xué)功能。蘋(píng)果屬于喜硝植物，氮脅迫會(huì)嚴(yán)重影響蘋(píng)果的生長(zhǎng)發(fā)育、果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量。有關(guān)蘋(píng)果CYS基因在氮脅迫下的功能研究，尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題前期鑒定了蘋(píng)果cystatins基因家族成員，在富平楸子中克隆出MpCYS4基因（即MdCYS21），并獲得過(guò)表達(dá)MpC

2、YS4基因的M26轉(zhuǎn)基因植株。本研究在此基礎(chǔ)上，系統(tǒng)的分析了蘋(píng)果CYS基因在低氮脅迫下的表達(dá)的變化。采用組培、沙培和水培的實(shí)驗(yàn)手段研究了MpCYS4轉(zhuǎn)基因植株對(duì)低氮脅迫的抗性。獲得如下結(jié)果:
　　1、蘋(píng)果砧木M26低氮脅迫處理的結(jié)果表明:低氮處理顯著抑制了M26的生長(zhǎng)。低氮處理組M26的干重、株高、莖粗、葉綠素含量、凈光合速率等指標(biāo)顯著小于對(duì)照組，植株表現(xiàn)出典型的缺氮癥狀。在課題前期研究基礎(chǔ)上，選取6個(gè)蘋(píng)果CYS基因，分析其在低氮

3、脅迫下的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，這6個(gè)基因均受低氮脅迫的誘導(dǎo)，表達(dá)量上調(diào)顯著。初步確認(rèn)選取的6個(gè)蘋(píng)果CYS基因(MdCYS1、MdCYS8、MdCYS15、MdCYS20、MdCYS21、MdCYS26)均參與了M26低氮響應(yīng)過(guò)程。
　　2、組培法研究MpCYS4基因響應(yīng)低氮脅迫的結(jié)果表明:極低氮處理和無(wú)氮處理，轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于野生型。并且，轉(zhuǎn)基因植株的根系的根的數(shù)目、長(zhǎng)度、表面積等方面明顯大于野生型。初步表明MpCYS4基因的過(guò)量表達(dá)增強(qiáng)

4、了M26對(duì)氮脅迫的抗性。
　　3、沙培法研究MpCYS4基因響應(yīng)低氮脅迫的結(jié)果表明:低氮條件下，M26轉(zhuǎn)基因植株的根部和地上部的生物量、光合色素含量和凈光合速率明顯大于野生型，但是根冠比小于野生型。同時(shí)，MpCYS4基因的過(guò)量表達(dá)，導(dǎo)致低氮脅迫下葉片的氣孔導(dǎo)度下降，葉片中H2O2積累量顯著降低，而且成熟葉片中全氮含量大于野生型。
　　4、水培法研究MpCYS4基因響應(yīng)低氮脅迫的結(jié)果表明:低氮條件下，M26轉(zhuǎn)基因植株的根部和地

5、上部的生物量、光合色素含量明顯大于野生型。M26轉(zhuǎn)基因植株中超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)的活性顯著大于野生型，葉片中的H2O2積累量顯著低于野生型植株。M26轉(zhuǎn)基因植株葉片中硝酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因MdNPF6.8、MdNPF6.9、MdNRT2.4和MdNRT2.7的表達(dá)量上調(diào)顯著。
　　綜上所述，通過(guò)低氮脅迫下M26的表型與蘋(píng)果CYS基因表達(dá)，及過(guò)表達(dá)MpCYS4