表達(dá)人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4的非復(fù)制型腺病毒的構(gòu)建與鑒定.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的：構(gòu)建含有人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4基因的非復(fù)制型腺病毒表達(dá)載體()AdE/hBMP-4并檢測(cè)目的基因的表達(dá)，以期用于骨組織工程基因治療的研究。 方法：EcoRI雙酶切質(zhì)粒pCS2(+)/hBMP-4獲得目的基因片段，將hBMP-4基因片段首先克隆至非病毒真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，后利用該載體上含有的酶切位點(diǎn)KpnI和XbaI，再將hBMP-4基因片段定向克隆至腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV，接著用電穿孔法轉(zhuǎn)化至

2、含有骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的EcoliBJ5183/p中進(jìn)行同源重組，脂質(zhì)體法將腺病毒重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，利用HEK293細(xì)胞中表達(dá)的腺病毒E1蛋白將重組體包裝成含有hBMP-4基因的完整非復(fù)制型腺病毒，病毒顆粒感染HEK293和HeLa細(xì)胞，提取總RNA和總蛋白，進(jìn)行RT-PCR和Western-blot檢測(cè)。 結(jié)果：獲得了含有目的基因的非病毒真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/hBMP-4，經(jīng)酶切、測(cè)序構(gòu)建正

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