1、目的:骨肉瘤是由具有成骨潛能的骨間葉組織發(fā)展而來的惡性結(jié)締組織瘤，也是原發(fā)性惡性骨腫瘤之中發(fā)病率最高腫瘤之一。骨肉瘤有高度軟組織侵襲性以及遠處轉(zhuǎn)移傾向，在臨床表現(xiàn)出高度惡性。RASSF1A是新近發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，在骨肉瘤等多種腫瘤細胞中由于其啟動子區(qū)高度甲基化導(dǎo)致表達缺失，但其對于骨肉瘤的抑癌作用及抑癌作用機制尚未闡明。本研究探討RASSF1A基因?qū)侨饬黾毎鲋?、凋亡、細胞周期、遷移及侵襲的影響，并在此基礎(chǔ)上研究RASSF1A基因?qū)侨?/p>

2、瘤增殖遷移相關(guān)Wnt/β-catenin信號通路的作用，希望通過上述工作促進骨肉瘤靶向治療的開展。
　　方法:本項目構(gòu)建抑癌基因RASSF1A重組腺病毒并感染骨肉瘤細胞，在細胞水平探討RASSF1A基因與骨肉瘤的關(guān)系。首先利用免疫印跡法(Western Blot)檢測幾種骨肉瘤細胞系中RASSF1A蛋白的表達情況;在沒有RASSF1A基因表達的骨肉瘤細胞系MNNG/HOSC1中，利用腺病毒載體過表達RASSF1A，檢測RASSF1

3、A基因過表達對骨肉瘤增殖(MTT實驗)、細胞周期、凋亡（流式實驗）、遷移和侵襲(Transwell小室實驗)的影響;定量PCR的方法分析RASSF1A對于骨肉瘤相關(guān)基因MMP7、C-myc、Cyclin D1表達的影響。通過免疫印跡法分析RASSF1A對Wnt/β-catenin信號通路中幾個關(guān)鍵蛋白的表達和磷酸化的影響;最后利用骨肉瘤裸鼠皮下成瘤模型對RASSF1A的抑癌作用進行了初步研究。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建腺病毒穿梭載體pY

4、r-Ads-4-shutter-RASSF1A，并通過腺病毒重組技術(shù)獲得有感染能力的過表達RASSF1A基因的腺病毒。證明RASSF1A基因在不同來源的骨肉瘤細胞系中表達有差異，Saos-2及MNNG/HOSC1細胞系中低表達。進一步實驗證明RASSF1A基因能夠引起骨肉瘤細胞MNNG/HOSC1的細胞G1/S期阻滯、引起細胞增殖速度降低并促進細胞凋亡。同時感染RASSF1A腺病毒的MNNG/HOSC1細胞與對照腺病毒細胞相比，其侵襲、

5、遷移能力也都明顯受到抑制，并且MMP7、C-myc、Cyclin D等促進腫瘤細胞增殖、遷移以及侵襲的關(guān)鍵基因表達量下調(diào)。細胞信號通路分析發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤細胞系MNNG/HOSC1中過表達RASSF1A基因?qū)е耊nt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵蛋白β-catenin的降解和入核蛋白量減少，β-catenin的上游關(guān)鍵蛋白GSK3β磷酸化程度下降，MST1/MST2磷酸化水平上升。裸鼠皮下成瘤模型推測RASSF1A可能抑制腫瘤的生長。<