1、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是全球第一大非感染性肝病,它是胰島素抵抗(IR)和遺傳易感性相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝臟損害,其主要疾病譜表現(xiàn)為單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、NASH相關(guān)肝硬化(NASH-LC)及肝癌。雖然“二次打擊”學(xué)說已成為解釋NAFLD的經(jīng)典理論,但可能發(fā)病機制尚未闡明。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是真核細(xì)胞中一種重要的細(xì)胞器,它主要參與蛋白質(zhì)的合成、組裝、折疊、運輸、細(xì)胞內(nèi)鈣的儲存,以及脂質(zhì)代謝與類固醇激素

2、的合成。在缺氧、氧化應(yīng)激、異常糖基化反應(yīng)以及Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡等情況下,未折疊蛋白增多,超出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的處理能力時,可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)。
　　ERS分為三種類型:
　　(1)細(xì)胞核因子κB(NF-κB)引發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超負(fù)荷反應(yīng)(EOR);
　　(2)固醇調(diào)節(jié)級聯(lián)反應(yīng);
　　(3)未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)。在肝細(xì)胞脂肪變性過程中,ERS的調(diào)控十分重要,且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)與NAFLD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),ERS中的

3、未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)在NASH、糖尿病等代謝疾病引起的肝損害進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。然而NAFLD如何啟動,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脂質(zhì)負(fù)荷的增多如何引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未正確折疊蛋白的增多,肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)負(fù)荷過載與ERS的發(fā)生之間更直接的聯(lián)系是什么,這些問題并未得到明確回答。
　　Sec61蛋白是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上重要的通道蛋白,也是未折疊蛋白轉(zhuǎn)運及后續(xù)的未折疊蛋白降解途徑(ERAD)的核心結(jié)構(gòu),對ERS的平衡,維持ER復(fù)雜功能起著重要作用。它包括α、β、γ亞基,其

4、主要功能是形成疏水通道,使核糖體合成的新生多肽通過并穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)腔,完成正確折疊。作為一種通道蛋白,Sec61是否在肝細(xì)胞脂肪變性模型中發(fā)生了變化,是否參與肝細(xì)胞脂肪變性的過程,目前尚未見報道。因此,本研究建立軟脂酸與油酸混合物體外誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性模型,檢測Sec61α與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+密切相關(guān)的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94(GRP94)、Bcl-2,以及ERS標(biāo)志蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)的表達(dá),探討Sec61α在肝細(xì)胞脂肪變性中的

5、可能作用機制。
　　方法:
　　1.應(yīng)用軟脂酸與油酸混合物(PA:OA=1:2)誘導(dǎo)L02肝細(xì)胞發(fā)生肝細(xì)胞脂肪變性,建立非酒精性脂肪性肝病肝細(xì)胞脂肪變體外模型,分為正常對照組與脂肪變性組,分別于0h、2h、4h、8h及16h收獲細(xì)胞。
　　2.采用油紅O染色顯示肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)脂滴情況,利用相差倒置顯微鏡觀察其脂肪變化程度;每組肝細(xì)胞隨機選取5個視野進(jìn)行采圖,并應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行圖像分析,以平均脂變面積評價肝細(xì)胞脂

6、變程度。
　　3.根據(jù)L02細(xì)胞脂肪變性過程中,是否加入Sec61抑制劑EeyarestatinⅠ,將細(xì)胞分為正常對照組、脂肪變性組、Sec61抑制劑組及DMSO組。
　　4.利用qRT-PCR及Western blot檢測各時相點Sec61α、GRP78、GRP94及Bcl-2的表達(dá)變化。
　　5.采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1.油紅O染色評價軟脂酸與油酸混合物誘導(dǎo)L02肝細(xì)

7、胞脂肪變情況油紅O染色后顯微鏡下觀察,脂滴為紅色,而隨著造模時間延長,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)脂滴明顯增多,逐漸融合成點片狀,并呈現(xiàn)逐漸增加趨勢。2 h的脂變面積為3.36±0.32,4 h為22.53±2.16,8 h為85.27±13.82,12 h253.94±21.68,16 h為427.56±29.73,均較0 h顯著升高(P<0.01)。
　　2. qRT-PCR檢測L02肝細(xì)胞脂肪變性過程中,Sec61α與GRP78的mRNA動態(tài)變

8、化水平在mRNA水平,以0 h的表達(dá)為1,Sec61αmRNA相對表達(dá)量在細(xì)胞脂肪變模型早期(2 h、4 h)出現(xiàn)下降(P>0.05),而在后期增加(8 h、12 h、16 h, P<0.05);GRP78的表達(dá)也呈逐漸上升態(tài)勢,8 h明顯上升(P<0.05),在12 h、24 h較0 h顯著升高(P<0.01)。
　　3.Western blot檢測L02肝細(xì)胞脂肪變性過程中,Sec61α與GRP78蛋白的動態(tài)變化水平在蛋白水平

9、上,Sec61α在肝細(xì)胞脂肪變性早期下降(2 h,4 h,P>0.05),晚期升高(8 h,12h,P<0.05)的變化規(guī)律;GRP78蛋白表達(dá)呈逐漸上升的變化規(guī)律(P<0.05)。
　　4.油紅O染色評價應(yīng)用Sec61抑制劑 EeyarestatinⅠ處理后,肝細(xì)胞脂肪變性程度油紅O染色后顯微鏡下觀察,DMSO組與脂肪變性組的脂變面積差異不明顯,無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而抑制劑組與脂肪變性組的脂變面積差異明顯(P<0.01

10、)。
　　5.Western blot檢測應(yīng)用Sec61抑制劑后各組蛋白表達(dá)變化在蛋白水平,脂肪變性組與 DMSO組比較,無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),而抑制劑組中 Sec61α與 GRP78蛋白水平與脂肪變性組相比,明顯降低(P<0.01);GRP94與Bcl-2則明顯升高(P<0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.應(yīng)用軟脂酸與油酸混合物可成功建立肝細(xì)胞脂肪變性體外模型,且隨時間延長,肝細(xì)胞胞質(zhì)中脂滴面積也不斷增加。

11、r>　　2.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激貫穿于肝細(xì)胞脂肪變的整個過程,隨時間延長,ERS逐漸加重。
　　3.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)孔道蛋白Sec61在肝細(xì)胞脂肪變性過程中的早期(2 h,4 h)先下降,此時ERS雖有發(fā)生,但程度較輕,Sec61的變化可能是一種適應(yīng)性變化。在肝細(xì)胞脂肪變后期(8 h,12 h,16 h),Sec61隨ERS進(jìn)一步加重,表達(dá)逐漸升高。在加入Sec61抑制劑后,ERS明顯減輕,肝細(xì)胞脂肪變性程度同步減輕,提示在肝細(xì)胞脂肪變性過程中, S