1、第一部分 利用胎兒血紅蛋白表型顯微操作分選母血中胎兒有核紅細(xì)胞 目的建立高純度、高特異性的細(xì)胞分選技術(shù)，富集純化母血中胎兒有核紅細(xì)胞(fetalnucleatedredbloodcells，F(xiàn)NRBC)并探索最佳分選時(shí)機(jī)。方法188例孕婦外周血，經(jīng)密度梯度離心初步富集后行血紅蛋白γ鏈(gammachainofheamoglobin，γ-Hb)免疫組化染色，以顯微操作技術(shù)挑取陽性細(xì)胞。采用單細(xì)胞引物延伸預(yù)擴(kuò)增(primer

2、extensionpreamplification，PEP)及聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction，PCR)技術(shù)檢測(cè)Y染色體特異性片段SRY基因。結(jié)果胎兒有核紅細(xì)胞具有鮮明的形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)特征。188例母血中每例檢測(cè)0.6×108個(gè)有核細(xì)胞，186例可檢出FNRBC，數(shù)目為5～89個(gè)。正常妊娠孕婦共160例，早、中、晚孕FNRBC的數(shù)目分別為10.44±3.19，29.96±4.10，22.00±3.55，三組之

3、間具有極顯著差異(P＜0.01)，以中孕組最高。胎兒生長(zhǎng)受限(fetalgrowthrestriction，F(xiàn)GR)妊娠18例，母血中FNRBC數(shù)均顯著高于同孕期正常妊娠組(P＜0.01)。Down綜合征胎兒及Turner綜合征胎兒各1例，分別檢出胎兒有核紅細(xì)胞89、43個(gè)，顯著高于同孕齡正常均值。對(duì)胎兒NRBC進(jìn)行SRY基因的PEP-PCR檢測(cè)，男胎檢出率為95.74％(90/94)，女胎未檢出率為100％(92/92)，判斷胎兒性別

4、的準(zhǔn)確率為97.85％(182/186)。結(jié)論以血紅蛋白γ鏈為分選標(biāo)志，結(jié)合顯微操作技術(shù)，可以有效獲取高純度、高濃度研究模板，為后繼準(zhǔn)確、特異的細(xì)胞來源鑒定及基因分析奠定基礎(chǔ)。中孕時(shí)母血中FNRBC數(shù)目最高，胎兒染色體非整倍體異常妊娠FNRBC升高，可為進(jìn)一步的無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷提供依據(jù)和指導(dǎo)。 第二部分 應(yīng)用短串聯(lián)重復(fù)序列鑒定母血中胎兒有核紅細(xì)胞 目的:探索X染色體短串聯(lián)重復(fù)序列(shorttandemrepeat

5、s，STR)位點(diǎn)在無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷中用于胎兒細(xì)胞鑒定、性別判斷等的可行性。方法47對(duì)孕婦及其配偶外周血，以血紅蛋白γ鏈染色結(jié)合顯微操作分離獲取母血中胎兒有核紅細(xì)胞，經(jīng)PEP擴(kuò)增細(xì)胞基因組后，對(duì)2個(gè)X染色體STR位點(diǎn)DXS101、DXS6797及AMXY(XandYamelogeninalleles)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。同時(shí)對(duì)各對(duì)夫妻外周血DNA進(jìn)行上述基因位點(diǎn)擴(kuò)增，聚丙烯酰胺及瓊脂糖電泳后胎兒樣本及其雙親的基因型對(duì)比分析判斷胎兒性別及NR

6、BC來源。結(jié)果3例擴(kuò)增失敗，其他44例聯(lián)用DXS101、DXS6797及AMXY基因診斷女胎、男胎的靈敏度分別為90％(18/20)、91.67％(22/24)，胎兒性別診斷符合率為90.91％(40/44)。結(jié)論采用多個(gè)X-STR位點(diǎn)及AMXY基因擴(kuò)增作為母血中胎源細(xì)胞鑒定系統(tǒng)，不局限于男胎，可準(zhǔn)確鑒定細(xì)胞來源并判斷胎兒性別，而且快速、價(jià)廉，具有廣闊的發(fā)展前景。 第三部分 利用母血中胎兒有核紅細(xì)胞產(chǎn)前診斷染色體非整倍體

7、異常 試驗(yàn)一母血中胎兒有核紅細(xì)胞熒光原位雜交診斷染色體非整倍體異常 目的:探討利用孕婦外周血中胎兒有核紅細(xì)胞進(jìn)行染色體非整倍體異常的產(chǎn)前診斷的可行性。方法根據(jù)B型超聲及孕中期AFP、uE3、β-HCG三聯(lián)血清學(xué)檢測(cè)，從進(jìn)行遺傳咨詢的114例孕婦中篩選出高危孕婦，另有1例產(chǎn)婦，因新生兒為Down綜合征(Downsyndrome，DS)兒于產(chǎn)后6天采集母血。以血紅蛋白γ鏈染色結(jié)合顯微操作分離獲取母血中胎兒有核紅細(xì)胞，采用CE

8、PX/Y及LSI21探針對(duì)孕產(chǎn)婦血樣中的胎兒FNRBC進(jìn)行熒光原位雜交分析。結(jié)果共篩選出高危孕婦34例，分娩DS兒產(chǎn)婦1例，共16例接受母血中胎兒NRBC的熒光原位雜交(Fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH)分析。FISH結(jié)果示Down綜合征兒2例，Turner綜合征兒2例，男胎8例，女胎8例。除1例診為Turner綜合征胎兒的實(shí)際核型為正常二倍體男性外，其余15例FISH結(jié)果均與實(shí)際核型一致，診斷符

9、合率為93.75％(15/16)。結(jié)論利用母血中胎兒有核紅細(xì)胞進(jìn)行熒光原位雜交可成功診斷胎兒非整倍體異常，在國(guó)內(nèi)尚屬首例，并為該無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)走向臨床應(yīng)用奠定了實(shí)踐基礎(chǔ)。 試驗(yàn)二短串聯(lián)重復(fù)序列用于染色體非整倍體異常的無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷 目的:探索短串聯(lián)重復(fù)序列用于無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷21號(hào)染色體及性染色體非整倍體異常的可行性。方法進(jìn)行遺傳咨詢的孕產(chǎn)婦及其配偶共50對(duì)，其中產(chǎn)婦及配偶1對(duì)，其余為孕婦及配偶。以血紅蛋白γ鏈染色結(jié)合

10、顯微操作分離獲取母血中胎兒有核紅細(xì)胞，經(jīng)PEP擴(kuò)增細(xì)胞基因組后，對(duì)3個(gè)21染色體位點(diǎn)D21S11、D21S1411、D21S1412，2個(gè)X染色體STR位點(diǎn)DXS101、DXS6797及AMXY基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。同時(shí)對(duì)各對(duì)夫妻外周血DNA進(jìn)行上述基因位點(diǎn)擴(kuò)增，聚丙烯酰胺及瓊脂糖電泳后胎兒及其雙親的基因型對(duì)比分析。結(jié)果50例胎兒細(xì)胞樣本有3例擴(kuò)增失敗。其余47例D21S11、D21S1411及D21S1412位點(diǎn)的有效信息率分別為85.

11、11％(40/47)、78.72％(37/47)、76.60％(36/47)。3個(gè)STR位點(diǎn)聯(lián)合應(yīng)用，對(duì)45例樣本成功鑒定了細(xì)胞的胎兒源性并準(zhǔn)確判斷胎兒21號(hào)染色體的數(shù)目，符合率為95.74％(45/47)。檢出2例Down綜合征兒，與其實(shí)際核型相符。DXS101+DXS6797+AMXY基因診斷女胎、男胎的靈敏度分別為90.48％(19/21)、92.31％(24/26)，胎兒性別診斷符合率為91.49％(43/47)。同時(shí)成功診斷1