1、本實驗旨在探討P38MAPK信號通路在羅格列酮治療常染色體顯性遺傳性多囊腎病中的重要作用及其可能機制。體內(nèi)實驗結(jié)果表明：免疫組化實驗觀察大鼠正常腎組織、多囊腎組織、羅格列酮治療后多囊腎組織中P38、磷酸化P38(P-P38)和NF-кB的分布及表達變化，實驗發(fā)現(xiàn)在自發(fā)突變的ADPKD動物模型Han：SPRD大鼠腎臟組織中P38、P-P38和NF-кB表達均明顯高于正常對照大鼠，分布部位有一致性；三種抗體在正常腎小管上皮細胞主要分布于胞漿

2、，多囊腎囊腫襯里上皮細胞中易位至細胞核內(nèi)，羅格列酮治療后可明顯減少其細胞核內(nèi)分布。Western blot和RT-PCR半定量檢測不同組織P38和P-P38表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)P38和P-P38在多囊腎組織蛋白中表達明顯高于正常對照組(P<0.05)，純合子表達高于雜合子，雄性雜合子表達高于雌性雜合子，羅格列酮治療后可明顯減少P38和P-P38在多囊腎組織表達，由此可見P38和P-P38的表達與病情嚴重程度正相關(guān)，P38和核轉(zhuǎn)錄因子NF-кB

3、與前期工作研究的TGF-β和MCP-1一樣在羅格列酮治療多囊腎病中發(fā)揮重要作用。 體外實驗通過：主要在脂多糖(LP S)(10ug/ml)誘導炎癥的犬遠端腎小管上皮細胞(MDCK)中探討P38信號通路及羅格列酮與鈣離子和細胞因子TGF-β、MCP-1和NF-кB的關(guān)系。分別予羅格列酮(RGZ)不同劑量(0、10、20、50、100、200umol/L)及RGZ(10umol/L)、PPARγ抑制劑(GW9662)(10umol/

4、L)、RGZ+GW9662、P38特異性抑制劑SB203580(10 umol/L)、RGZ+SB203580、鈣離子螯合劑BAPTAM-AM(10umol/L)、RGZ+BAPTAM-AM預刺激細胞2小時后，予LPS刺激MDCK細胞。觀察各組： 1)Western blot檢測不同試劑刺激后P38、P-P38蛋白變化。 2)免疫細胞化學觀察TGF-β1、MCP-1表達。 3)RT-PCR檢測P38、TGF-β1

5、、MCP-1mRNA變化。 4)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染報告基因檢測NF-кB活性。 5)激光掃描共聚焦顯微鏡用FLUO-3AM鈣離子熒光探針檢測細胞內(nèi)鈣離子變化。 實驗結(jié)果表明：Western blot、RT-PCR及免疫細胞化學分析顯示： ①LPS刺激MDCK細胞，P-P38在5分鐘后達到高峰，而P38于6小時后開始升高，12小時達高峰；為羅格列酮等不同試劑刺激細胞觀察P38和P-P38變化選擇刺激時間點提供依據(jù)。

6、 ②不同濃度羅格列酮分別作用于細胞，結(jié)果顯示羅格列酮明顯下調(diào)P38、P-P38表達，并與劑量相關(guān)，下調(diào)程度在50umol/L組最低，而100umol/L和200umol/L組對P38和P-P38下調(diào)程度較50umol/L組明顯減弱，并有活化P38趨勢。 ③RGZ、GW9662、RGZ+GW9662、SB203580、RGZ+SB203580、BAPTAM-AM、RGZ+BAPTAM-AM作用于細胞，結(jié)果顯示RGZ組、SB2

7、03580組、RGZ+SB203580組、BAPTM-AM組和RGZ+BAPTAM-AM組可明顯下調(diào)P38、P-P38及細胞因子TGF-β和MCP-1表達，其中RGZ+SB203580組與RGZ組相比下調(diào)程度無統(tǒng)計學意義，提示羅格列酮可能通過抑制P38活化和表達下調(diào)其下游因子TGF-β和MCP-1的表達；而BAPTM-AM組和RGZ+BAPTAM-AM組下調(diào)程度較RGZ組明顯增強，提示鈣離子可能并不參與羅格列酮對P38、P-P38及其下

8、游因子的調(diào)節(jié)過程；GW9662單用組對以上因子無影響，而RGZ+GW9662組可部分阻斷羅格列酮下調(diào)程度。 結(jié)論：羅格列酮可能通過減少P38表達和活化，繼之抑制MCP-1、TGF-β1表達和NF-кB活性改善多囊腎病中的間質(zhì)炎癥反應和纖維化。羅格列酮的這些抑制作用是非鈣離子依賴的，部分是非PEARγ依賴的。本項實驗還發(fā)現(xiàn)高濃度羅格列酮可使細胞內(nèi)鈣離子升高，這可能參與其水潴留的副作用，可能成為研發(fā)新型PPARy激動劑及聯(lián)合用藥新的