1、目的：　　本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上，在體外模擬血管外壁組織結(jié)構(gòu)，利用外膜成纖維細胞(AFB)和平滑肌細胞(SMC)在微孔多聚碳酸酯膜(Polyethylene terephalate，PET膜)上共培養(yǎng)，對血管外壁的縫隙連接信息通道進行研究；模擬體內(nèi)自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)環(huán)境，從外膜層加入不能透過PET膜的氧合血紅蛋白(oxygenated hemoglobin，OxyHb)，

2、觀察共培養(yǎng)體系中未接觸氧合血紅蛋白的平滑肌細胞的形態(tài)及縫隙連接蛋白Cx43mRNA的改變；并應用RNA干擾技術(shù)，特異性Cx43 siRNA沉默外膜成纖維細胞的Cx43后，觀察外膜層加入氧合血紅蛋白后對側(cè)未接觸氧合血紅蛋白平滑肌細胞的形態(tài)及縫隙連接蛋白的改變。為進一步研究血管外壁縫隙連接通道與SAH后的腦血管痙攣關(guān)系奠定基礎(chǔ)。方法：　　1.原代培養(yǎng)兔基底動脈平滑肌細胞和兔胸主動脈外膜成纖維細胞并鑒定。分別取兔基底動脈中層、兔胸主動脈外

3、層，應用組織貼塊法培養(yǎng)平滑肌細胞和外膜成纖維細胞，用光學相差顯微鏡、免疫細胞化學染色鑒定。　　2.以微孔多聚碳酸酯膜(PET膜)作為載體，模擬血管壁外彈力層，將血管壁外膜成纖維細胞(AFB)和平滑肌細胞(SMC)分別接種于PET膜的兩側(cè)，建立AFB-PET-SMC血管外壁重構(gòu)模型。　　3.在PET膜兩側(cè)分別接種AFB和SMC，在AFB側(cè)加入10<'-6>M濃度OxyHb的培養(yǎng)液，而另一側(cè)的SMC培養(yǎng)液中無OxyHb，共培養(yǎng)24h后，

4、利用分光光度儀分別檢測PET膜AFB、SMC側(cè)培養(yǎng)液中OxyHb的吸光度?！　?.透射電鏡觀察共培養(yǎng)模型中外膜成纖維細胞和對側(cè)平滑肌細胞形成的縫隙連接，劃痕染料傳輸實驗檢測該縫隙連接通道功能，RT-PCR檢測外膜成纖維細胞和平滑肌縫隙連接蛋白Cx43 mRNA的表達?！　?.在PET膜一側(cè)接種AFB并加入含l0<'-6>M濃度OxyHb的培養(yǎng)液，而另一側(cè)接種SMC且培養(yǎng)液中無OxyHb，分別共培養(yǎng)24h、48h、72h三個處理組，另

5、設(shè)一條件組即AFB和SMC未直接接觸培養(yǎng)(余條件同處理組)72h、正常對照72h組和OxyHb直接處理SMC組，分別應用光鏡，掃描電鏡，透射電鏡觀察SMC的長度和超微結(jié)構(gòu)，雙盲法測量未接觸OxyHb的平滑肌細胞長度的改變，重復3次。　　6.特異性Cx43 siRNA轉(zhuǎn)染外膜成纖維細胞24h后，和SMC在PET膜上進行共培養(yǎng)；在PET膜一側(cè)的AFB并加入含10<'-6>M濃度OxyHb的培養(yǎng)液，而另一側(cè)接種SMC且培養(yǎng)液中無OxyHb，

6、分別共培養(yǎng)24h、48h、72h組、脂質(zhì)體72h組、非特異性siRNA72h組和未轉(zhuǎn)染72h組，應用掃描電鏡雙盲法測量未接觸OxyHb的平滑肌細胞長度的改變，重復3次。　　7.異硫氰酸胍/酚/氯仿抽提法提取SMC和AFB總RNA行RT-PCR，檢測各組平滑肌細胞和外膜成纖維細胞縫隙連接蛋白Cx43mRNA含量(n=3)，β-actin引物為擴增時提供內(nèi)參，對電泳結(jié)果進行圖像分析，以目的產(chǎn)物和β-actin產(chǎn)物的灰度值之比作為該種蛋白m

7、RNA在血管組織中的相對含量，重復3次，記錄結(jié)果，均數(shù)±標準差，采用t檢驗，進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果：　　1.原代培養(yǎng)兔基底動脈平滑肌細胞和兔胸主動脈外膜成纖維細胞并鑒定，相差倒置顯微鏡下觀察平滑肌呈梭形，多層重疊生長，為典型的峰谷狀，抗α-actin免疫化學染色陽性。外膜成纖維細胞多角形或多極梭形，胞體大而扁平，多為單層成嵴狀生長，抗Vimentin免疫化學染色陽性。 2.建立血管外壁部分重構(gòu)模型，AFB-PET-SMC組

8、織結(jié)構(gòu)關(guān)系類似于體內(nèi)血管外層(成纖維細胞-外彈力層-平滑肌細胞)結(jié)構(gòu)。　　3.AFB側(cè)培養(yǎng)液可見OxyHb的吸收峰，SMC側(cè)培養(yǎng)液無OxyHb吸收峰，氧合血紅蛋白不能透過PET膜滲透至對側(cè)。 　 4.透射電鏡觀察可見AFB和SMC間能透過微孔形成縫隙連接結(jié)構(gòu)，劃痕染料傳輸實驗結(jié)果顯示AFB和SMC間形成的縫隙連接通道有通訊功能，RT-PCR顯示AFB和SMC均有Cx43mRNA的表達?！　?.掃描電鏡測量結(jié)果顯

9、示：在AFB側(cè)加入OxyHb處理24h，48h，72h均能使對側(cè)未經(jīng)OxyHb處理的SMC產(chǎn)生收縮，SMC平均長度分別為41.68±9.21μm，0xyHb處理24h，48h，72h后，對側(cè)未經(jīng)0xyHb處理的SMC長度分別為：50.68±13.2Pm、45.34±9.87μm、36.80±14.25Pm，與未轉(zhuǎn)染72h組21.59±10.28m比有顯著性差異(P<0.05)；脂質(zhì)體72h組20.36±13.08μm和非特異性siRNA

10、72h組22.48±12.14μm與未轉(zhuǎn)染72h組比無顯著性差異(p>0.05)。對側(cè)未經(jīng)0xyHb處理的SMC Cx43 mRNA相對含量分別為1.328±0.11、1.335±0.1 1、1.57±0.12與未轉(zhuǎn)染72h組2.35±0.18比顯著下調(diào)(p<0.05)，脂質(zhì)體組2.20±0.17和非特異性siRNA組相對含量分別為2.28±0.16與未轉(zhuǎn)染72h組2.35±0.18比無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論：　　1.血管

11、外壁的外膜成纖維細胞和平滑肌細胞間(AFB-SMC)存在縫隙連接信息通道，結(jié)合我們前期已經(jīng)證實的外膜成纖維細胞間(AFB-AFB)和已知的內(nèi)皮細胞間(EC-EC)、平滑肌細胞間(sMc-EC)、內(nèi)皮細胞與平滑肌細胞間(EC-SMC)存在的縫隙連接信息通道，首次提出血管壁上存在豐富的縫隙連接網(wǎng)絡(AFB-AFB，AFB-SMC，SMC-SMC，SMC-EC，EC-EC)?！　?.建立了一種可供研究腦血管痙攣的新型細胞模型，該模型為研究縫

12、隙連接信息通道以及腦血管痙攣的分子機制提供了較為理想的方法?！　?.0xyHb作用血管外壁的AFB后可以引起未對側(cè)直接接觸0xyHb的平滑肌細胞發(fā)生持續(xù)收縮，提示AFB在氧合血紅蛋白誘導的平滑肌收縮過程中可能發(fā)揮重要作用?！　?.0xyHb作用AFB后，AFB和SMC的Cx43 mRNA含量均明顯上調(diào)，特異性siRNA干擾AFB Cx43后，能有效抑制OxyHb誘導的SMC收縮及Cx43 mRNA上調(diào)，提示縫隙連接信息通道參與了Ox