1、目的：在成骨分化過程中，若祖細胞在向終末成骨分化為成骨細胞過程中的信號通路中斷，可導致骨肉瘤的生成。誘導骨肉瘤細胞向成骨方向分化，可能會抑制骨肉瘤細胞的惡性表型，因此，我們應用AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)，構建具有成骨分化作用的人LMP-1基因腺病毒重組體，感染體外培養(yǎng)的骨肉瘤細胞系U2OS，并鑒定LMP-1基因在U2OS中的表達，為研究骨肉瘤細胞成骨分化奠定基礎。
　　 方法：以K562細胞的cDNA為文庫，采用PCR方法對LM

2、P-1進行擴增，將目的基因通過TA克隆與pGEM-T載體連接并測序。雙酶切后將目的基因插入至腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdtrack-CMV，經(jīng)雙酶切和測序鑒定，轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞系并通過熒光顯微鏡、RT-qPCR和Western blot檢測pAdtrack-CMV-LMP-1的表達。線性化pAdtrack-CMV-LMP-1，在BJ5183菌內(nèi)完成與骨架質(zhì)粒pAdeasy-1的同源重組，構建重組腺病毒質(zhì)粒AdLMP-1。通過脂質(zhì)體介導在

3、HEK-293A細胞內(nèi)包裝出重組腺病毒AdLMP-1，大量擴增、純化并測定滴度。用AdLMP-1感染骨肉瘤細胞系U2OS，通過熒光顯微鏡、RT-qPCR和Western blot檢測LMP-1在U2OS細胞中的表達。
　　 結果：限制性雙酶切和DNA測序鑒定穿梭質(zhì)粒pAdtrack-CMV-LMP-1構建成功，熒光顯微鏡證實轉(zhuǎn)染了pAdtrack-CMV-LMP-1質(zhì)粒的HEK-293T細胞質(zhì)內(nèi)有綠色熒光蛋白表達；RT-qPCR

4、發(fā)現(xiàn)與空白對照、空載轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染后24h，HEK-293T細胞LMP-1 mRNA表達量升高800倍，轉(zhuǎn)染后48h后升高1500倍，與對照組相比有統(tǒng)計學差異(*p<0.01)；Western blot驗證了LMP-1及His標簽蛋白的表達量明顯高于對照組。AdLMP-1通過擴增、純化滴度達到1.5x109pfu/ml。熒光顯微鏡下觀察AdLMP-1感染的U2OS內(nèi)有綠色熒光蛋白表達；RT-qPCR發(fā)現(xiàn)與空白對照、轉(zhuǎn)染空載AdGFP組