1、傷寒（typhiod fever）又稱為腸熱?。╡nteric fever），是一種古老的由傷寒沙門菌（Salmonella typhi，S.typhi）引起的急性腸道傳染病。20世紀(jì)80年代末至90年代初，我國十三省市曾發(fā)生大規(guī)模多重耐藥傷寒沙門菌的暴發(fā)流行。對591例傷寒沙門菌臨床分離株進行藥敏、質(zhì)粒電泳、接合轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)化及消除試驗后發(fā)現(xiàn)，流行期間分離的多重耐藥菌株均含一分子量98.6×106道爾頓（98.6 Md，約159 Kb）的

2、耐藥質(zhì)粒，可編碼對多種藥物的抗性，屬不相容性C群（IncC），稱之為pRST98。該質(zhì)粒具有多效性，除編碼抗藥性外還能增強宿主菌的毒力，是一種既能介導(dǎo)細菌耐藥性又能增強細菌毒力的具有雙重功能的“嵌合型”質(zhì)粒。傷寒沙門菌是兼性胞內(nèi)致病菌，具有靶向感染專職抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC）的特點，侵入機體后可定居在樹突狀細胞（dendritic cell，DC）內(nèi)生長繁殖。DC是連接天然免疫和獲得性免疫的

3、橋梁，在抗沙門菌感染免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，任何對DC功能的干擾都可能影響感染結(jié)局。
　　本研究通過建立沙門菌感染的細胞模型和實驗動物模型，研究傷寒沙門菌質(zhì)粒pRST98對DC成熟及其自噬過程和免疫功能的影響，揭示其增強宿主菌毒力的發(fā)生機理，為下一步繼續(xù)深入研究質(zhì)粒的毒力機制提供實驗和理論依據(jù)。
　　第一部分，傷寒沙門菌質(zhì)粒對DC成熟和自噬過程影響的體外實驗
　　以攜帶 pRST98的野生株 S.typhi-WT、消除

4、 pRST98的傷寒沙門菌突變株S.typhi-Δ-pRST98以及 pRST98經(jīng)接合轉(zhuǎn)移重新導(dǎo)入 S.typhi-Δ-pRST98所獲得的回補株S.typhi-c-pRST98為研究對象，將細菌與小鼠骨髓來源的 DC（bone marrow-derived DC，BMDC）共培養(yǎng)建立體外感染模型。分別在感染的不同時間段（2 h、4 h、12 h和24 h）收獲細胞，采用以下方法進行實驗檢測：①流式細胞術(shù)（flow cytometry

5、， FCM）檢測DC表面共刺激分子CD40、CD80和CD86的表達以及DC的吞噬能力；②酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測細胞Th1型細胞因子γ-干擾素（Interferon-γ，IFN-γ）和白細胞介素-12（interleukin-12，IL-12）及Th2型細胞因子IL-10的表達；③ Western Blot（WB）檢測細胞自噬標(biāo)志蛋白——微管相關(guān)蛋白1輕鏈3

6、-II（Microtubule-associated protein1 light chain3-II， MAP1-LC3-II，即LC3-II）和Beclin-1的表達；④透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察細胞內(nèi)自噬小體。
　　實驗結(jié)果表明，① S.typhi-WT感染組DC表面CD40、CD80和CD86的表達量均顯著低于S.typhi-Δ-pRST98感染組（P<0.05

7、，P<0.01，P<0.01）；S.typhi-c-pRST98感染組與 S.typhi-Δ-pRST98感染組比較， CD40和 CD86的表達量均顯著低于S.typhi-Δ-pRST98感染組（P均<0.05）；S.typhi-WT感染組和S.typhi-c-pRST98感染組DC的吞噬率均顯著高于S.typhi-Δ-pRST98感染組（P均<0.05）；② S.typhi-WT感染組DC的IFN-g和IL-12的分泌量均顯著低于S

8、.typhi-Δ-pRST98感染組（P均<0.01），而IL-10分泌量顯著高于S.typhi-Δ-pRST98感染組（P<0.05），S.typhi-c-pRST98感染后，除了 IL-10的分泌量與 S.typhi-Δ-pRST98感染組無顯著差異外（P>0.05），IFN-g和IL-12分泌量顯著低于S.typhi-Δ-pRST98感染組（P<0.01，P<0.05）；③ S.typhi-Δ-pRST98感染細胞Beclin-1

9、的表達量顯著高于S.typhi-WT和S.typhi-c-pRST98感染組，同時S.typhi-Δ-pRST98感染細胞LC3-II表達增強，而S.typhi-WT和S.typhi-c-pRST98感染組LC3-II僅有微弱表達；④ S.typhi-Δ-pRST98感染DC內(nèi)可見典型的自噬小體。感染后2h和4h有部分細菌被雙層或多層膜包裹形成自噬泡，多層膜包裹S.typhi-Δ-pRST98形成的自噬小體于感染后12 h與溶酶體融合形

10、成自噬溶酶體，感染后24 h觀察到內(nèi)化的細菌被降解。攜帶嵌合型質(zhì)粒pRST98的S.typhi-WT感染DC內(nèi)未觀察到自噬小體結(jié)構(gòu)。
　　第二部分，傷寒沙門菌質(zhì)粒對免疫功能影響的體內(nèi)實驗
　　感染的發(fā)生和發(fā)展過程極其復(fù)雜，體內(nèi)多種因素參與調(diào)節(jié)并決定感染的結(jié)局，建立動物模型能進一步揭示致病菌與宿主相互作用。傷寒沙門菌是一種嚴(yán)格只對人類致病的病原體，沒有合適的動物模型和有效的遺傳學(xué)工具，本研究利用與其有非常近緣關(guān)系的鼠傷寒沙門菌

11、（S.typhimurium）的研究途徑來研究pRST98質(zhì)粒毒力基因。
　　S.typhimurium SR-11是攜帶一分子量為100 kb毒力質(zhì)粒的鼠傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)毒株，本研究將SR-11毒力質(zhì)粒消除后得到的菌株χ3337作為陰性對照，質(zhì)粒pRST98經(jīng)接合導(dǎo)入χ3337形成接合子χ3337/pRST98為研究對象，按以下方法進行實驗：①如第一部分建立體外感染模型，于感染后2 h收集DC，分別進行細胞破膜活菌計數(shù)和Annex

12、in V-FITC/ PI雙染FCM檢測，觀察不同菌株侵襲DC的能力及對細胞凋亡的影響；②將實驗菌株尾靜脈感染小鼠，于不同時間段（1 d、3 d、5 d和10 d）處死小鼠，收獲脾細胞懸液，F(xiàn)CM檢測脾臟DC的數(shù)量及表面CD40、CD80、CD86和MHCⅡ的表達；脾臟DC胞內(nèi)細胞因子TNF-a、IL-12和IFN-g的分泌水平；脾臟T淋巴細胞亞群比例及細胞活化指標(biāo)CD44和CD62L的表達情況；③平板菌落計數(shù)法檢測感染后肝臟和脾臟內(nèi)活

13、菌數(shù)。
　　實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①感染2 h，χ3337和χ3337/pRST98感染組DC內(nèi)細菌數(shù)量無顯著性差別（P>0.05）；χ3337/pRST98感染組凋亡率顯著高于χ3337感染組（P<0.05）；② S.typhimurium感染后小鼠脾臟細胞總數(shù)在感染χ3337后3 d、5 d和10 d明顯增多（P<0.01，P<0.05，P<0.01）；感染3 d開始，DC絕對數(shù)量高于control組（P<0.01）；DC絕對數(shù)量和百

14、分比在感染5 d（P<0.01，P<0.05）和10 d（P均<0.05）均高于control組；感染χ3337/pRST98后3 d，脾細胞總數(shù)顯著高于未感染組（P<0.05）；感染5 d，細胞總數(shù)、DC絕對數(shù)量和百分比均顯著升高（P均<0.05）；感染10 d，脾細胞總數(shù)和DC絕對數(shù)量仍均顯著高于control組（P均<0.05）；χ3337感染組小鼠在感染后5 d，CD11c+DC絕對數(shù)量以及相對數(shù)量都顯著高于χ3337/pRST

15、98感染組（P均<0.05）；小鼠感染S.typhimurium后，CD40、CD80、CD86和 MHCⅡ的表達量均顯著增加；χ3337/pRST98感染組與χ3337感染組比較，CD11c+DC除了CD40的表達量無顯著差異（P>0.05），CD80、CD86和MHCⅡ的表達量均顯著低于χ3337感染組（P<0.05，P<0.01，P<0.05）；S.typhimurium感染后，小鼠脾臟 CD11c+DC的TNF-a、IL-12和

16、IFN-g分泌量顯著增加；χ3337/pRST98感染組小鼠脾臟CD11c+DC的IL-12和IFN-g分泌量顯著低于χ3337組（P均<0.05），不同菌株感染組間TNF-a的分泌量無顯著差異（P>0.05）；③對照組小鼠、感染χ3337小鼠和感染χ3337/pRST98小鼠脾臟中CD3+CD4+Th細胞和CD3+CD8+Tc細胞在淋巴細胞中所占比例這兩項指標(biāo)均無差異（P>0.05）；χ3337和χ3337/pRST98感染后10 d

17、淋巴細胞表面CD44表達量顯著增高（P均<0.05）；淋巴細胞CD62LlowT細胞群比例顯著增加（P均<0.05）；χ3337感染組小鼠在感染后10 d，CD44high和CD62Llow T細胞比例都顯著高于χ3337/pRST98感染組（P均<0.05）；細菌感染第10 d，兩組小鼠肝臟和脾臟的活菌數(shù)均達到較高水平，χ3337組的肝臟、脾臟活菌數(shù)明顯低于χ3337/pRST98組（P均<0.05）。
　　結(jié)論
　　1．

18、傷寒沙門菌質(zhì)粒 pRST98對宿主菌侵襲 DC的能力未見明顯改變，但能抑制DC自噬，誘導(dǎo)凋亡，促進細菌在DC內(nèi)的存活和增殖，從而加重細胞損傷。
　　2．傷寒沙門菌質(zhì)粒pRST98能影響DC分泌細胞因子的水平，抑制Th1型細胞因子IFN-γ和IL-12，促進Th2型細胞因子IL-10的表達，表明質(zhì)粒pRST98具有轉(zhuǎn)換不同免疫應(yīng)答類型的能力，使宿主菌毒力增強實現(xiàn)免疫逃逸。
　　3．?dāng)y帶 pRST98質(zhì)粒的沙門菌毒力株能通過抑制