1、目的：通過(guò)細(xì)胞模型和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，研究沙門(mén)菌毒力基因(Salmonella plasmid virulence genes，spv)對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)自噬、凋亡和免疫調(diào)節(jié)功能的影響及其分子機(jī)制，探索通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬和凋亡水平增強(qiáng)機(jī)體免疫功能以控制感染進(jìn)程的新途徑，并為后續(xù)新藥靶位的發(fā)現(xiàn)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：⑴細(xì)胞模型的體外實(shí)驗(yàn)。以攜帶spv基因的傷寒沙門(mén)菌(Salmonella t

2、yphi，ST)ST8為研究對(duì)象，用含spv基因的鼠傷寒沙門(mén)菌標(biāo)準(zhǔn)毒株SR-11作為陽(yáng)性對(duì)照、不攜帶spv基因的傷寒沙門(mén)菌ST10作為陰性對(duì)照，將細(xì)菌與小鼠骨髓來(lái)源的DCs(bone marrow-derived DCs，BMDCs)共培養(yǎng)；同時(shí)用不加細(xì)菌的正常細(xì)胞作對(duì)照組；另設(shè)自噬激動(dòng)劑雷帕霉素(rapamycin，RAPA)干預(yù)組，即將細(xì)胞預(yù)先用含RAPA的培養(yǎng)基過(guò)夜處理后分別與上述三種細(xì)菌共培養(yǎng)。分別于不同時(shí)間段收獲細(xì)胞，用Wes

3、tern blot法檢測(cè)BMDCs自噬蛋白Beclin-1的表達(dá)，比色法測(cè)定其Caspase-3的活性，流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)分析BMDCs的凋亡率、吞噬能力以及表面共刺激分子CD40、CD80和CD86的表達(dá)，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mixed lymphocyte reaction，MLR)檢測(cè)BMDCs刺激CD4+和CD8+初始型T(naive T)細(xì)胞增殖的能力，ELISA法測(cè)定培養(yǎng)液上清中IL-12、IF

4、N-γ、IL-10和IL-4等細(xì)胞因子的水平，臺(tái)盼藍(lán)染色法進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)BMDCs內(nèi)活菌數(shù)。⑵小鼠模型的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。由于傷寒沙門(mén)菌是一種嚴(yán)格只對(duì)人類致病的病原體，沒(méi)有合適的動(dòng)物模型和有效的遺傳學(xué)工具，本實(shí)驗(yàn)利用與其有非常近緣關(guān)系的鼠傷寒沙門(mén)菌建立動(dòng)物感染模型，用鼠傷寒沙門(mén)菌標(biāo)準(zhǔn)毒株SR-11和不攜帶spv基因的低毒株BRD509經(jīng)腹腔注射感染小鼠；同時(shí)以未感染細(xì)菌的小鼠作為正常對(duì)照組；另設(shè)RAPA干預(yù)組，即在感染模型建

5、立后每天經(jīng)腹腔注射適量RAPA。分別在不同時(shí)間段觀察小鼠一般狀態(tài)，處死小鼠后比較肝臟和脾臟的病理變化，免疫組化法檢測(cè)肝臟和脾臟Beclin-1和Caspase-3蛋白的表達(dá)，F(xiàn)CM分析脾臟DCs的凋亡率、吞噬能力及表面共刺激分子CD40、CD80和CD86的表達(dá)，MLR檢測(cè)脾臟DCs刺激naive T細(xì)胞增殖的能力，ELISA法測(cè)定血清中IL-12、IFN-γ、IL-10和IL-4等細(xì)胞因子的水平，平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)小鼠肝臟和脾臟的活菌

6、數(shù)。
　　 結(jié)果：①用RAPA干預(yù)前，細(xì)菌與BMDCs共作用后2 h，ST10組的Beclin-1表達(dá)量高于SR-11組和ST8組，RAPA干預(yù)后0 h即可出現(xiàn)此差異；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)菌感染早期，BRD509組小鼠臟器的Beclin-1表達(dá)高于SR-11組。用RAPA干預(yù)后體內(nèi)外各組Beclin-1的表達(dá)均升高。②用RAPA干預(yù)前，體內(nèi)外各組DCs的凋亡率和Caspase-3活性均隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高。體外實(shí)驗(yàn)SR-11組和S

7、T8組高于ST10組，用RAPA干預(yù)后，SR-11組和ST8組下降，而ST10組上升；體內(nèi)小鼠脾臟DCs的凋亡率和Caspase-3活性表現(xiàn)為SR-11組高于BRD509組，用藥后SR-11組降低，而B(niǎo)RD509組升高。③用RAPA干預(yù)前，隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)各組DCs的吞噬能力均不斷下降。體外實(shí)驗(yàn)ST10組的吞噬率低于SR-11組和ST8組；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)BRD509組的吞噬率低于SR-11組。用RAPA干預(yù)后，體內(nèi)外各組DCs的吞

8、噬率均明顯下降。④用RAPA干預(yù)前，體內(nèi)外各組DCs表面共刺激分子CD40、CD80和CD86的表達(dá)均隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，刺激naive T細(xì)胞增殖的能力也不斷增強(qiáng)。體外實(shí)驗(yàn)顯示ST10組明顯強(qiáng)于SR-11組和ST8組；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)BRD509組明顯強(qiáng)于SR-11組。用RAPA干預(yù)后，體內(nèi)外各組DCs共刺激分子的表達(dá)均上升，naive T細(xì)胞的增殖程度亦升高。⑤用RAPA干預(yù)前，體內(nèi)外各組IL-12和IFN-γ水平隨著時(shí)間延長(zhǎng)顯著升高

9、。體外表現(xiàn)為ST10組明顯高于SR-11組和ST8組；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)BRD509組明顯高于SR-11組。用RAPA干預(yù)后，體內(nèi)外各組IL-12和IFN-γ的水平均上升。⑥用RAPA干預(yù)前，體內(nèi)外各組在細(xì)菌感染早期均未檢測(cè)到IL-10。體外感染后期SR-11組和ST8組BMDCs分泌的IL-10大量增加，明顯高于ST10組；體內(nèi)感染后期SR-11組的IL-10有表達(dá)，而B(niǎo)RD509則仍檢測(cè)不到。用RAPA干預(yù)后，體內(nèi)外各組IL-10的表達(dá)水平均

10、低于用藥前。不管RAPA干預(yù)與否，各組均未檢測(cè)到IL-4的表達(dá)。⑦用RAPA干預(yù)前，體外實(shí)驗(yàn)SR-11組和ST8組BMDCs的存活率低于ST10組，而胞內(nèi)活菌數(shù)則SR-11組和ST8組高于ST10；體內(nèi)感染后期，SR-11組小鼠的一般狀態(tài)較BRD509組差，臟器病理變化嚴(yán)重，活菌數(shù)亦較高。用RAPA干預(yù)后，體外實(shí)驗(yàn)SR-11組和ST8組BMDCs的存活率升高，而ST10組降低，胞內(nèi)活菌數(shù)表現(xiàn)為SR-11組和ST8組降低，而ST10組升高

11、；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)SR-11組臟器內(nèi)活菌數(shù)降低而B(niǎo)RD509組升高，SR-11組臟器較用藥前損傷減輕而B(niǎo)RD509組加重。
　　 結(jié)論：⑴攜帶spv基因的沙門(mén)菌由于毒力較強(qiáng)，可通過(guò)抑制自噬，促進(jìn)凋亡而加重感染，用RAPA干預(yù)其體內(nèi)外感染模型后自噬被適度激活可對(duì)細(xì)胞和機(jī)體起到一定的保護(hù)作用；而無(wú)spv基因的沙門(mén)菌可通過(guò)適度激活自噬以減少細(xì)菌對(duì)細(xì)胞和機(jī)體的損害，對(duì)自身起到保護(hù)作用，當(dāng)自噬被RAPA過(guò)度增強(qiáng)后，反而導(dǎo)致宿主的損傷。⑵攜帶spv