1、目的:通過(guò)細(xì)胞感染模型，研究傷寒沙門菌質(zhì)粒pRST98和沙門菌質(zhì)粒毒力基因(Salmonella plasmid virulence gene，spv)對(duì)巨噬細(xì)胞(macrophage)自噬和凋亡的影響及其分子機(jī)制。
　　 方法:
　　 一.傷寒沙門菌質(zhì)粒pRST98對(duì)巨噬細(xì)胞自噬和凋亡的影響及分子機(jī)制研究。
　　 以攜帶pRST98的傷寒沙門菌(Salmonella enterica serovar Typhi

2、，S.typhi)野生株ST8、消除pRST98的突變株ST8-⊿pRST98和將pRST98經(jīng)接合轉(zhuǎn)移重新導(dǎo)入ST8-⊿pRST98所獲得的回補(bǔ)株ST8-c-pRST98感染人巨噬細(xì)胞THP-1，以此作為感染模型，分別用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素( Rapamycin，RAPA)和NO合酶抑制劑L-硝基精氨酸甲酯（nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME）進(jìn)行干預(yù)。將細(xì)菌和細(xì)胞共培養(yǎng)30 min后吸除上清，此時(shí)

3、定為“0點(diǎn)”，加入含100μg/ml的阿米卡星(Amikacin，AMK)的培養(yǎng)液作用2h以去除胞外菌，然后將AMK濃度降為10μg/ml抑制從感染細(xì)胞中釋放至培養(yǎng)液中的細(xì)菌生長(zhǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)至各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)。分別在細(xì)胞感染模型的0點(diǎn)、感染后2h和6h收集細(xì)胞或上清液。用流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)巨噬細(xì)胞自噬蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubuleassociated protein1 light chain

4、3，LC3)-Ⅱ的表達(dá)和Sub-G1凋亡峰，透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，Western blot法檢測(cè)巨噬細(xì)胞自噬蛋白Beclin-1和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，比色法測(cè)定Caspase-3的活性，Griess法檢測(cè)NO(nitric oxide)含量，ELISA法檢測(cè)TNF-α含量，平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)胞內(nèi)活菌數(shù)。
　　 二.沙門菌質(zhì)粒毒力基因sp

5、v對(duì)巨噬細(xì)胞自噬和凋亡的影響及分子機(jī)制研究。
　　 由于傷寒沙門菌只感染人類的嚴(yán)格宿主特異性，缺乏理想的動(dòng)物模型，為今后進(jìn)一步在動(dòng)物活體內(nèi)研究pRST98上spv的功能，本部分實(shí)驗(yàn)使用鼠傷寒沙門菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium，S.typhimurium）開(kāi)展相應(yīng)實(shí)驗(yàn)，以攜帶sPv的鼠傷寒沙門菌野生株UF009和敲除spv的鼠傷寒沙門菌突變株UF110感染鼠巨噬細(xì)胞J774A.1

6、，以此作為感染模型，并用p38抑制劑SB203580進(jìn)行干預(yù)。細(xì)菌和細(xì)胞共培養(yǎng)1h后吸除上清，此時(shí)定為“0點(diǎn)”，AMK的應(yīng)用同第一部分。分別在細(xì)胞感染模型的0點(diǎn)、感染后2h、6h和24 h收集細(xì)胞或上清液進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。用FCM檢測(cè)巨噬細(xì)胞自噬蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)和Sub-G1凋亡峰，Western blot法檢測(cè)巨噬細(xì)胞自噬蛋白Beclin-1和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，Griess法檢測(cè)NO的含量。
　　 結(jié)果:

7、>　　 一.傷寒沙門菌質(zhì)粒pRST98對(duì)巨噬細(xì)胞自噬和凋亡的影響及分子機(jī)制研究。
　　 1.FCM和Western blot檢測(cè)自噬蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1結(jié)果顯示，細(xì)胞感染模型的0點(diǎn)，ST8和ST8-c-pRST98感染組細(xì)胞LC3-Ⅱ(P＜0.01)和Beclin-1的表達(dá)量均顯著低于ST8-⊿pRST98組;感染后2h，各感染組細(xì)胞LC3-Ⅱ(P＞0.05)和Beclin-1的表達(dá)量未見(jiàn)明顯差異。
　　

8、2.FCM檢測(cè)Sub-G1凋亡峰結(jié)果顯示，感染后2h，各感染組細(xì)胞凋亡率未見(jiàn)明顯差異(P＞0.05);感染后6h，ST8和ST8-c-pRST98感染組細(xì)胞凋亡率顯著高于ST8-⊿pRST98組(P＜0.01)。電鏡結(jié)果與FCM檢測(cè)結(jié)果一致，感染后2h，各感染組細(xì)胞均可見(jiàn)染色質(zhì)邊聚等凋亡改變，但各組細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象未見(jiàn)明顯差異;感染后6h，ST8和ST8-c-pRST98感染組凋亡細(xì)胞明顯多于ST8-⊿pRST98感染組。Western

9、blot檢測(cè)抗凋亡蛋白Bcl-2，亦發(fā)現(xiàn)感染后6h，ST8和ST8-c-pRST98感染組細(xì)胞Bcl-2表達(dá)量顯著低于ST8-⊿pRST98組。
　　 3.比色法檢測(cè)Caspase-3活性結(jié)果顯示，感染后2h，各感染組細(xì)胞Caspase-3活性未見(jiàn)明顯差異（P＞0.05）;感染后6h，ST8和ST8-c-pRST98感染組細(xì)胞Caspase-3活性高于ST8-⊿pRST98組（P＜0.05）。
　　 4.細(xì)胞上清液中NO

10、和TNF-α測(cè)定結(jié)果顯示，感染后2h和6h，ST8和ST8-cpRST98感染組細(xì)胞NO(P＜0.01)和TNF-α（2h，P＜0.01;6h，P＜0.05）產(chǎn)生量均低于ST8-⊿pRST98感染組。而平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活菌數(shù)結(jié)果顯示，ST8和ST8-c-pRST98感染組細(xì)胞內(nèi)活菌數(shù)高于ST8-⊿pRST98感染組（2h，P＜0.05;6h，P＜0.01)。
　　 5.用自噬誘導(dǎo)劑RARA干預(yù)后，ST8和ST8-c-pR

11、ST98感染組細(xì)胞的凋亡率(P＜0.01)和細(xì)胞內(nèi)活菌數(shù)降低(2h，P＜0.05;6h，P＜0.01)，而ST8-⊿pRST98感染組未見(jiàn)明顯變化(P＞0.05)。
　　 6.用NO合酶抑制劑L-NAME干預(yù)后，ST8-⊿pRST98感染組細(xì)胞LC3-Ⅱ表達(dá)量顯著下降(P＜0.01)，凋亡率(P＜0.01)和Caspase-3活性(P＜0.05)上升，而ST8和ST8-c-pRST98感染組未見(jiàn)明顯變化(P＞0.05)。

12、　　 二.沙門菌質(zhì)粒毒力基因sPv對(duì)巨噬細(xì)胞自噬和凋亡的影響及分子機(jī)制研究。
　　 1.FCM和Western blot檢測(cè)自噬蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1結(jié)果顯示，細(xì)胞感染模型的0點(diǎn)，UF009感染組細(xì)胞LC3-Ⅱ(P＜0.01)和Beclin-1的表達(dá)量均顯著低于UF110感染組;感染后2h，UF009和UF110感染組細(xì)胞LC3-Ⅱ（P＞0.05）和Beclin-1的表達(dá)量未見(jiàn)明顯差異。
　　 2.用p38的

13、抑制劑SB203580干預(yù)后，細(xì)胞感染模型的0點(diǎn)，UF009感染組細(xì)胞LC3-Ⅱ（P＞0.05）和Beclin-1的表達(dá)量未見(jiàn)明顯變化，而UF110感染組細(xì)胞LC3-Ⅱ(P＜0.01)和Beclin-1的表達(dá)量顯著下降。
　　 3.FCM檢測(cè)Sub-G1凋亡峰結(jié)果顯示，感染后2h，UF009和UF110感染組細(xì)胞凋亡率未見(jiàn)明顯差異(P＞0.05);感染后6h和24 h，UF009感染組細(xì)胞凋亡率顯著高于UF110感染組(P＜0.

14、01)。Western blot檢測(cè)抗凋亡蛋白Bcl-2結(jié)果顯示，感染后2h，UF009和UF110感染組細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)量未見(jiàn)明顯差異;感染后6h，UF009感染組細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)量略低于UF110感染組，兩組之間差異不顯著;感染后24 h，UF009感染組細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)量顯著低于UF110感染組。
　　 4.用p38的抑制劑SB203580干預(yù)后，F(xiàn)CM結(jié)果顯示，感染后6h和24 h，UF009感染組細(xì)胞凋亡率

15、未見(jiàn)明顯變化(P＞0.05)，而UF110感染組細(xì)胞凋亡率上升(P＜0.05); Western blot結(jié)果顯示，感染后24 h，UF009感染組細(xì)胞Bcl-2表達(dá)量未見(jiàn)明顯變化，而UF110感染組細(xì)胞Bcl-2表達(dá)量顯著下降。
　　 5.Griess法檢測(cè)細(xì)胞上清液中NO結(jié)果顯示，感染后2h、6h和24 h，UF009感染組細(xì)胞NO產(chǎn)生量均顯著低于UF110感染組(P＜0.01)。
　　 6.用p38抑制劑SB203

16、580干預(yù)后，各時(shí)間段UF009感染組細(xì)胞NO產(chǎn)生量未見(jiàn)明顯變化(P＞0.05)，而UF110感染組細(xì)胞NO產(chǎn)生量顯著降低(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，傷寒沙門菌質(zhì)粒pRST98在感染早期通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞自噬抵抗殺菌作用，使細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)的活菌數(shù)量增加，而在后期則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。用自噬誘導(dǎo)劑RAPA干預(yù)細(xì)胞感染模型并激活自噬，能夠減輕攜帶pRST98的傷寒沙門菌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡。pRST98對(duì)巨