1、骨骼肌的分化發(fā)育是一個(gè)精細(xì)的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控過(guò)程，有多種功能性分子參與其中。Long non-coding RNA(lncRNA)是一類調(diào)控多種生物學(xué)功能的非編碼RNA，在癌癥和腫瘤組織中被廣泛的研究。目前針對(duì)影響肌肉分化發(fā)育的lncRNA研究已有初步進(jìn)展，但仍有大量lncRNA有待挖掘。本研究以高通量芯片技術(shù)為主要研究策略，結(jié)合差異表達(dá)的lncRNA和mRNA，鑒定出兩個(gè)受MyoD因子調(diào)控并影響肌細(xì)胞分化的lncRNA，主要研究結(jié)果如下:

2、r>　　1.利用MyoD特異的siRNA轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞，待細(xì)胞分化2天后收集RNA和蛋白質(zhì)，采用Q-PCR和Western Blotting技術(shù)檢測(cè)敲低效率，同時(shí)檢測(cè)調(diào)控上游/下游基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MyoG、MyHC表達(dá)量隨著MyoD基因干擾顯著下降，上游基因無(wú)變化。利用lncRNA和mRNA芯片篩選了敲低MyoD后差異表達(dá)的lncRNA和mRNA，得到642個(gè)下調(diào)表達(dá)和335個(gè)上調(diào)表達(dá)的lncRNA。通過(guò)相關(guān)性分析，找出與這些差異變化

3、lncRNA相關(guān)的差異mRNA，利用軟件對(duì)這些mRNA進(jìn)行GO和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)這些基因大都富集在與肌肉生成或肌肉運(yùn)動(dòng)相關(guān)的通路中。
　　2.從基因芯片結(jié)果中篩選了37個(gè)表達(dá)量高且芯片差異倍數(shù)大的lncRNA，在小鼠13個(gè)組織中研究了基因表達(dá)情況。結(jié)果顯示，9個(gè)lncRNA(MM9LINCRNAEXON11961-、AK141672、AK031663、ENSMUST00000150337、AK017263、ENSMUST0000

4、0154720、AK160312、AK163925、ENSMUST00000104935)在肌肉組織中高表達(dá)，AV570737等8個(gè)lncRNAs在睪丸組織高表達(dá)，AK139402等4個(gè)lncRNAs在腦中高表達(dá)，AK052777等7個(gè)lncRNAs在肝、腎中高表達(dá)，AK143003等9個(gè)lncRNAs廣譜表達(dá)。
　　3.從肌肉高表達(dá)和廣譜表達(dá)的lncRNAs中篩選9個(gè)進(jìn)一步分析。構(gòu)建MyoD超表達(dá)載體反向驗(yàn)證9個(gè)候選lncRNA

5、s的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)AK143003、AK017263、ENSMUST00000150337的表達(dá)發(fā)生顯著變化。分析了這3個(gè)lncRNAs在不同分化時(shí)間的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)量均在分化初期顯著上升，AK143003高表達(dá)能夠一直維持到分化末期，而AK017263和ENSMUST00000150337在分化末期表達(dá)降低。
　　4.鑒定分析了AK017263的基因序列，發(fā)現(xiàn)它是一個(gè)位于基因間的lncRNA，且轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)有MyoD、My

6、oG的結(jié)合。利用RACE技術(shù)得到了AK017263的全長(zhǎng)序列，并對(duì)其編碼能力進(jìn)行預(yù)測(cè)，證明AK017263是一個(gè)非編碼RNA。核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)說(shuō)明AK017263不論在細(xì)胞增殖期還是分化期，均存在于細(xì)胞核中。利用特異的siRNA降低AK017263的表達(dá)，Q-PCR、Western Blotting檢測(cè)結(jié)果表明分化標(biāo)志基因MyoG和MyHC表達(dá)量顯著下降，證明AK017263可促進(jìn)成肌細(xì)胞分化。
　　5.鑒定分析AK143003的序列

7、，發(fā)現(xiàn)它位于基因間，在它的轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)上游有一個(gè)編碼基因Mxd4。Northern、RACE和體外翻譯實(shí)驗(yàn)證明了AK143003是一個(gè)單拷貝的非編碼RNA。利用核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)，鑒定出AK143003在細(xì)胞增殖期核質(zhì)均有分布，細(xì)胞分化期則全部轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中。利用特異的siRNA和構(gòu)建成功的超表達(dá)載體對(duì)AK143003在肌細(xì)胞的功能進(jìn)行分析，Q-PCR、Western Blotting、免疫熒光檢測(cè)MyoG和MyHC的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)降低AK14300

8、3的表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞分化，而增加AK143003的表達(dá)抑制細(xì)胞分化。另外，降低AK143003的表達(dá)，其鄰近基因Mxd4表達(dá)升高，反之降低。這說(shuō)明AK143003可能通過(guò)降低Mxd4的表達(dá)負(fù)調(diào)控肌肉分化。但Mxd4對(duì)肌肉分化的作用還未有人研究。鑒于此，利用真核表達(dá)載體和特異siRNA構(gòu)建Mxd4過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)模型檢測(cè)其對(duì)肌分化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，降低Mxd4后，MyHC表達(dá)量降低，細(xì)胞分化受到抑制;超表達(dá)Mxd4，MyHC表達(dá)量增加，促