1、原發(fā)性肝癌(主要指肝細胞癌，簡稱肝癌)是世界第三位、我國第二位癌癥死亡原因。手術切除仍是早期肝癌的首選治療策略，然而由于肝癌的多灶性及早期血管侵犯等特性，術后5年的復發(fā)或轉移風險仍然高達70％。盡管針對復發(fā)瘤可二次切除，但大多數(shù)患者已無手術機會。對于遠處轉移的患者，常規(guī)治療手段大都無效。復發(fā)轉移已成為肝癌患者的主要死因，即使早期肝癌也可有較高轉移潛能，腫瘤生長與轉移可同時進行。
　　 由于影像學未能發(fā)現(xiàn)的微衛(wèi)星灶及微血管侵犯的存

2、在，大部分肝癌“根治性切除”手術實質上屬于姑息性切除。原發(fā)瘤一旦被切除，殘余癌細胞及術前已播散的異位癌細胞可能獲得或增強轉移潛能，形成復發(fā)、轉移灶或轉移至新的組織器官。姑息性手術所造成的系列影響可能是術后復發(fā)轉移的主要原因。因此研究姑息性切除對殘余肝癌侵襲轉移潛能的影響及其干預具有重要臨床意義。
　　 姑息性切除術后血管旺生，但往往幼稚且結構不完整，造成殘癌缺氧加重。一方面缺氧的殘癌細胞侵襲轉移潛能增強，另一方面結構異常的新生血

3、管更有利于殘癌細胞侵出血管及在轉移靶器官定植，最終導致復發(fā)轉移。因此，具潛在促血管正常化的藥物可能抑制腫瘤轉移。
　　 丹參酮Ⅱ A是從中藥丹參提取的活性單體成分，常用于心腦血管疾病患者，亦常用于肝炎患者，具有活血化瘀、改善微循環(huán)的作用。我組既往研究發(fā)現(xiàn)含丹參的五味中藥“松友飲”可抑制姑息性切除術后肝癌轉移，然其機制未明。我們認為其活血化瘀作用可能包含促血管正?；饔?。
　　 本課題首先選用高轉移潛能人肝癌MHCC97H

4、細胞系，建立單肝葉雙瘤原接種的肝癌姑息性切除術后裸鼠殘癌模型。再應用高轉移潛能人肝癌HCCLM3和低轉移潛能HepG2裸鼠模型，驗證術后殘癌侵襲轉移潛能變化，結果表明肝癌姑息性切除術后殘癌生長和轉移顯著增強。隨之我們將丹參酮Ⅱ A直接用于單瘤原原位接種模型，發(fā)現(xiàn)它不能抑制移植瘤生長但可減少轉移、顯著延長荷瘤裸鼠生存期。在此基礎上，我們進一步將它用于殘癌模型，觀察它對殘癌侵襲轉移的影響及主要作用機制。最后結合臨床實際，我們將丹參酮ⅠA與干

5、擾素α聯(lián)用，觀察它是否能減低后者的給藥劑量及縮短其給藥時間。
　　 1.肝癌姑息性切除術后裸鼠殘癌模型的建立
　　 采用單肝葉雙瘤原原位接種技術建立MHCC97H裸鼠原位移植瘤模型，行姑息性切除術(PR)切除1瘤，觀察5周。結果表明雙瘤模型的雙瘤成瘤率95.6％、PR成功率95.3％(手術死亡率4.7％)、裸鼠總體存活率90.2％，與單瘤原接種后行PR比較具有顯著優(yōu)勢，后者的成瘤率100％、手術死亡率73.3％、總體存活

6、率20％。成功建立姑息性切除術后的裸鼠殘癌模型。
　　 2.肝癌姑息性切除術后殘癌轉移顯著增強
　　 姑息性切除術(PR)組的平均腫瘤體積大于假手術(Sham)組(P<0.05)。與Sham組比較，PR組的肺轉移(僅HCCLM3)顯著增加(110.11±28.01vs7.22±4.71，P<0.001)、肝內播散和腹腔轉移亦顯著增加(P<0.05)，術后2天和35天的循環(huán)血腫瘤細胞比例也均顯著增加(P<0.001)。

7、r>　　 3.丹參酮ⅡA不能直接抑制移植瘤生長，但可減少轉移，延長荷瘤裸鼠生存期
　　 在單瘤給藥模型，生理鹽水、TanⅡA1，5，10 mg/kg/day四組的腫瘤大小無差別。與生理鹽水組比較，TanⅡA5和10 mg/kg/day組的肺轉移顯著減少(P=0.046和P<0.001)、肝內播散率和腹腔轉移也顯著降低(P<0.05)、生存期(見下)顯著延長(P<0.05)。分別與TanⅡA1和5 mg/kg/day組比較，10

8、 mg/kg/day組的肺轉移也顯著減少(P=0.003和P=0.046)。HepG2未發(fā)現(xiàn)腹腔轉移。TanⅡA10 mg/kg/day的抑制效果最強，因而被選用于后續(xù)實驗。
　　 4.丹參酮ⅡA顯著抑制肝癌姑息性切除術后殘癌轉移，延長裸鼠生存期
　　 PR后TanⅡA10 mg/kg/day給藥組殘癌體積較給生理鹽水組縮小，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與PR后給生理鹽水組比較，TanⅡA給藥組肺轉移(僅HCCLM

9、3)顯著減少(13.56±11.33 vs94.56±31.47，P<0.001)、肝內播散和腹腔轉移亦減少(P<0.01)、循環(huán)血腫瘤細胞比例(以腫瘤體積標準化后)則相對降低(P<0.001)。最重要的是，給藥過程中發(fā)現(xiàn)TanⅡA可顯著延遲荷殘癌裸鼠體重的下降；前述發(fā)現(xiàn)PR組裸鼠生存期顯著短于Sham組(P<0.01)；在單瘤給藥模型，TanⅡA較生理鹽水組可顯著延長荷瘤裸鼠生存期HCCLM3高達16天(P=0.004)及HepG2高

10、達19天(P<0.001)；在雙瘤給藥模型，TanⅡA還可使PR后縮短的生存期再顯著延長(HCCLM3:47.833±3.280 vs69.000±1.693；HepG2:52.167±2.496 vs79.667±2.940，均P=0.001)。
　　 5.丹參酮ⅡA不能抑制肝癌細胞增殖，但可降低其侵襲運動能力
　　 與0.1％DMSO(TanⅡA溶劑)對照組比較，TanⅡA0.01-100μmol/L(μM)各梯度濃

11、度組的光吸收值(OD值，代表細胞增殖密度)均無顯著變化；TanⅡA5和10μM組侵襲的細胞數(shù)均顯著減少(均P<0.01)，而TanⅡA1μM組不減少，差異無統(tǒng)計學意義。
　　 6.丹參酮ⅡA顯著改善殘癌缺氧，卻并不能下調體外肝癌細胞缺氧模型的HIF-1α表達
　　 PR后殘癌Pimonidazole和HIF-1α均顯著增加，與該變化一致，殘癌上皮-間質轉化(EMT)顯著增強(N-cadherin和Vimentin上調，E

12、-cadherin下調)；PR后給予TanⅡA使兩者均降低，同時殘癌EMT被逆轉；表明PR顯著促進殘癌缺氧并誘導殘癌細胞EMT變化，TanⅡA在體給藥可減輕殘癌缺氧同時抑制EMT。體外肝癌細胞低氧培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)HIF-1α、N-cadherin、Vimentin均上調、E-cadherin下調，然而加入TanⅡA干預發(fā)現(xiàn)，除E-cadherin被上調外，其余3個分子并未如預期結果被下調。進一步檢測發(fā)現(xiàn)TanⅡA確可直接上調腫瘤細胞E-cadh

13、erin。整個實驗中各分子的mRNA和蛋白表達變化基本一致。
　　 7.丹參酮ⅡA不改變殘癌微血管密度(MVD)，但顯著增加微血管完整度(MVI)
　　 鼠MVD以CD31為標記，NG2是血管周細胞的主要分子標記，在本研究用于評估MVI。PR組平均CD31密度高于Sham組(P<0.001)，而PR后給TanⅡA和生理鹽水兩組間CD31無差異。與Sham組比較，PR后NG2表達無改變，而PR后給TanⅡA組NG2水平顯著

14、升高(P<0.01)。連續(xù)切片免疫組化CD31、NG2、Pimonidazole染色發(fā)現(xiàn)，PR后給生理鹽水組殘癌CD31高、NG2低、缺氧嚴重(Pimonidazole染色面積大)；而PR后給TanⅡA組CD31高、NG2也高、因而缺氧較輕；表明PR后殘癌MVD增加、但MVI卻較低下，TanⅡA雖不能抑制MVD(血管生成)、但顯著增加MVI促進腫瘤血管完整。腫瘤血管掃描電鏡可直接觀察到TanⅡA組血管壁完整性明顯高于生理鹽水組。免疫熒光

15、雙標結果進一步證實TanⅡA不改變CD31、但上調NG2，因而降低殘癌缺氧。
　　 8.丹參酮ⅡA顯著增強內皮細胞(HUVECs、人和鼠TECs)體外成管能力，與上調VEGFR1和PDGFR表達密切相關
　　 體外常氧和低氧培養(yǎng)的HUVECs和人TECs的成管能力在加TanⅡA干預時均顯著增強。從PR后TanⅡA(in vivo)給藥組分選的TECs，其成管能力明顯強于從PR組分選的TECs。應用PR組TECs，結果發(fā)現(xiàn)

16、其成管能力亦可被體外加TanⅡA(in vitro)干預顯著增強，且與TanⅡA(in vivo)給藥組大致相當。流式細胞術分析發(fā)現(xiàn)TanⅡA(in vivo)給藥組TECs表面VEGFR1和PDGFR表達陽性細胞比例以及兩者的相對熒光強度均顯著高于PR(生理鹽水)組(P<0.05)，而兩組間VEGFR2、EGFR、FGFR1均無差異。應用VEGFR1/PDGFR選擇性抑制劑SU6668，結果進一步表明，TanⅡA體內外干預增強TECs

17、成管的能力被顯著削弱，而在無TanⅡA干預時SU6668的抑成管作用并不明顯。
　　 9.丹參酮ⅡA與干擾素α聯(lián)用，可使后者給藥劑量減少三分之一
　　 基于TanⅡA的上述發(fā)現(xiàn)，我們繼續(xù)比較PR后應用大劑量IFN-α(1.5×107U/kg/day)與聯(lián)用IFN-α劑量減低三分之一(1.0×107 U/kg)隔日給藥加TanⅡA(10 mg/kg/day)兩種給藥方式間療效的差別。結果發(fā)現(xiàn)，IFN-α單用組和聯(lián)用組的平均

18、腫瘤體積分別為0.391±0.411 cm3和0.756±0.349 cm3，兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.282)，且均小于生理鹽水組的3.160±0.405 cm3(P<0.001)；IFN-α單用組和聯(lián)用組的平均肺轉移灶個數(shù)分別為12.83±6.85和1.50±2.51，聯(lián)用組少于單用組(P=0.001)，且均少于生理鹽水組的29.33±6.95(P<0.001)；表明兩組間抑瘤效果無差異，IFN-α劑量減低三分之一隔日給藥與T

19、anⅡA聯(lián)用抑轉移作用強于大劑量IFN-α單用。
　　 結論：
　　 1.丹參酮Ⅱ A通過促進VEGFR1/PDGFR上調相關的腫瘤血管正?；种聘伟┕孟⑿郧谐g后殘癌轉移的增強，并延長荷殘癌裸鼠生存期。
　　 2.丹參酮Ⅱ A與干擾素α聯(lián)用，可使后者給藥劑量減低三分之一，而達大劑量干擾素α相當?shù)寞熜А?br>　　 創(chuàng)新點：
　　 1.首次發(fā)現(xiàn)丹參酮Ⅱ A可顯著抑制肝癌姑息性切除術后殘癌轉移的增強、并延

20、長生存期，其機制主要通過促進VEGFR1/PDGFR上調相關的腫瘤血管正?；瘉韺崿F(xiàn)。
　　 2.創(chuàng)建單肝葉雙瘤原的原位接種再行姑息性切除術的裸鼠殘癌模型。
　　 臨床應用前景和科學意義：
　　 1.本實驗發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA通過“血管正?；币种聘伟┣谐筠D移并延長生存期，將為臨床提供簡單易行副反應小的預防轉移復發(fā)的輔助療法，并可減少干擾素用量使病人耐受較長期用藥。
　　 2.本研究提示通過血管正常化的“疏導”