1、目的:為了研究TLR3在人類(lèi)胎盤(pán)HBV感染中的作用，本課題采用人群研究和體外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法，從基因和蛋白水平初步了解正常孕婦人群與HBsAg陽(yáng)性孕婦人群胎盤(pán)組織TLR3的表達(dá)和分布情況以及與HBV宮內(nèi)感染的關(guān)系，根據(jù)人群研究提供的線(xiàn)索進(jìn)一步進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，探索TLR3在胎盤(pán)細(xì)胞抵御HBV感染中的作用。 ①了解TLR3受體在正常孕婦和HBsAg陽(yáng)性孕婦胎盤(pán)組織的基因表達(dá)及蛋白分布情況； ②了解胎盤(pán)組織TLR3mRNA表達(dá)與

2、孕婦HBV感染的關(guān)系；從基因水平了解胎盤(pán)組織TLR3mRNA與孕婦外周血HBVDNA含量的關(guān)系以及與新生兒HBV宮內(nèi)感染的關(guān)系；從蛋白水平了解TLR3與胎盤(pán)HBV感染的關(guān)系及與新生兒HBV宮內(nèi)感染的關(guān)系； ③研究HBV感染對(duì)人胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞系Bewo中TLR3mRNA表達(dá)的影響，觀察人胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞系Bewo中TLR3抗HBV感染的生物學(xué)作用。 方法: ①普通半定量RT-PCR和RealtimeRT-PCR檢測(cè)正

3、常孕婦和HBsAg陽(yáng)性孕婦胎盤(pán)組織TLR3mRNA的表達(dá)情況，免疫組織化學(xué)ABC法檢測(cè)正常孕婦和HBsAg陽(yáng)性孕婦胎盤(pán)組織TLR3分布情況： ②熒光定量PCR檢測(cè)HBsAg陽(yáng)性孕婦及其新生兒HBVDNA含量； ③建立HBV體外感染人胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞模型；高濃度HBVDNA陽(yáng)性血清與Bewo細(xì)胞共培養(yǎng)，熒光定量PCR法檢測(cè)培養(yǎng)上清中HBVDNA含量；免疫組織化學(xué)ABC法檢測(cè)細(xì)胞爬片Bewo細(xì)胞中HBsAg； ④普通半

4、定量RT-PCR和RealtimeRT-PCR檢測(cè)人胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞系Bewo中，TLR3mRNA的表達(dá)；HBV感染前后人胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞系Bewo中TLR3mRNA表達(dá)的變化；利用PolyI:C刺激Bewo細(xì)胞TLR3mRNA的表達(dá)，設(shè)計(jì)合成特異的siRNA阻抑Bewo細(xì)胞TLR3mRNA的表達(dá)，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，RealtimeRT-PCR檢測(cè)三組細(xì)胞經(jīng)不同措施干預(yù)后TLR3mRNA的表達(dá)變化，同時(shí)檢測(cè)用108copies/ml濃度的HBV

5、DNA陽(yáng)性血清與上述三組細(xì)胞共同培養(yǎng)后上清液中HBVDNA含量的變化。 結(jié)果: ①半定量RT-PCR和RealtimeRT-PCR結(jié)果均顯示HBsAg陽(yáng)性孕婦胎盤(pán)組織TLR3mRNA含量低于正常孕婦胎盤(pán)組織(t=3.003，P＜0.05；t=4.698，P＜0.05)；免疫組化檢測(cè)41例正常孕婦胎盤(pán)TLR3全部陽(yáng)性，且各層細(xì)胞均顯示很強(qiáng)的免疫印跡，呈片狀分布；所檢116例外周血HBsAg陽(yáng)性孕婦胎盤(pán)組織中73.0％TLR

6、3受體陽(yáng)性，棕黃色信號(hào)局灶性分布于被檢胎盤(pán)的各型細(xì)胞中；TLR3在兩組的胎盤(pán)分布經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)差異有顯著性(Fisher's確切概率P＜0.01)； ②胎盤(pán)組織TLR3mRNA水平與孕婦外周血HBVDNA含量無(wú)關(guān)(F=0.147，P＞0.05)：胎盤(pán)組織TLR3mRNA水平與新生兒宮內(nèi)感染無(wú)關(guān)(t=0.888，P＞0.05)； ③從蛋白水平研究TLR3與胎盤(pán)HBV感染及與新生兒HBV宮內(nèi)感染的關(guān)系，結(jié)果顯示TLR3陽(yáng)性不僅

7、是胎盤(pán)HBV感染的保護(hù)因素(OR=0.259，0.189～0.354)，同時(shí)也是新生兒HBV宮內(nèi)感染的保護(hù)因素(OR=0.438，0.204～0.942)之一。 ④HBVDNA陽(yáng)性血清與Bewo細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)組、48小時(shí)組，在細(xì)胞感染后不同時(shí)段(24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí))的培養(yǎng)上清中均可檢出HBVDNA；免疫組織化學(xué)ABC法檢測(cè)細(xì)胞爬片Bewo細(xì)胞內(nèi)HBsAg的表達(dá)，陽(yáng)性物質(zhì)呈細(xì)小棕黃色顆粒，多數(shù)呈胞漿均質(zhì)型，少數(shù)呈胞漿

8、不均質(zhì)型，少數(shù)細(xì)胞核內(nèi)亦可見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)。光鏡下HBsAg陽(yáng)性細(xì)胞未見(jiàn)形態(tài)學(xué)上的明顯變化。 ⑤經(jīng)普通半定量RT-PCR和RealtimeRT-PCR檢測(cè)證實(shí)人胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞系Bewo中TLR3mRNA的表達(dá)呈陽(yáng)性；HBV感染Bewo細(xì)胞后TLR3mRNA表達(dá)高于對(duì)照組(t=4.479，P＜0.05)；PolyIC刺激Bewo細(xì)胞后，TLR3mRNA的表達(dá)水平高于siRNA組和對(duì)照組(H=13.087，P＜0.05；H=1.3.100

9、，P＜0.017)，siRNA組和對(duì)照組細(xì)胞TLR3mRNA含量無(wú)差別(H=3.287，P＞0.05)；用108copies/ml濃度的HBVDNA陽(yáng)性血清與上述三組細(xì)胞共同培養(yǎng)后，三組均可檢出HBVDNA，PolyI:C組上清中HBVDNA含量低于siRNA組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.531，P＜0.05)；siRNA組和對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LSD檢驗(yàn)P＞0.05)。 結(jié)論: ①胎盤(pán)組織TLR3表達(dá)情況與

10、孕婦乙型肝炎病毒感染有關(guān)，TuR3高表達(dá)是孕婦乙型肝炎病毒感染的保護(hù)因素； ②蛋白水平的檢測(cè)結(jié)果顯示，HBsAg陽(yáng)性孕婦胎盤(pán)組織TLR3陽(yáng)性率低于正常孕婦胎盤(pán)組織，TLR3是孕婦胎盤(pán)HBV感染的保護(hù)因素，同時(shí)也是HBV宮內(nèi)感染的保護(hù)因素； ③乙型肝炎病毒可在體外成功感染人胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞系Bewo;體外培養(yǎng)的人胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞系Bewo可穩(wěn)定表達(dá)TLR3，也可被乙型肝炎病毒直接感染，故此模型可作為研究HBV胎盤(pán)感染機(jī)制的良好