1、目的:
　　 TFF3(Trefoil Factor Family3)又稱腸三葉因子,是三葉肽家族的成員之一。它含有一個特殊的P結構域,后者由38-39個氨基酸組成,通過6個高度保守的半胱氨酸殘基經由3個分子內的二硫鍵相互連接使整個肽鏈扭曲折疊形成三葉狀結構,使其不受消化酶和PH變化的影響,在胃腸粘膜的損傷修復過程中發(fā)揮重要作用。TFF3的高表達與結腸癌的淋巴結轉移及較差的臨床預后相關,然而其機制尚不明確。我們小組在國際報道:結

2、腸癌細胞中,TFF3能夠持續(xù)上調EMT調節(jié)因子TWIST1的表達。FLV12作為轉錄因子TWIST1的靶基因,其在結腸癌的表達增高,與結腸癌的轉移相關。我們推測,TFF3可能通過上調TWIST1表達或激活其轉錄活性,進而上調FLV12,誘導結腸癌細胞發(fā)生EMT,促進結腸癌轉移。本研究意在探討TFF3/TWIST1/FLV12信號途徑在誘導結腸癌EMT,促進其侵襲、轉移過程中可能的調節(jié)機制。
　　 方法:
　　 1、構建實

3、驗相關表達載體,建立穩(wěn)轉細胞系。
　　 2、WesternBlot技術檢測TFF3在7種結腸癌細胞系的表達。
　　 3、RealTimePCR、RT-PCR方法檢測TFF3對TWIST1、FLV12轉錄水平的調節(jié),WesternBlot方法檢測TFF3對TWIST1、FLV12、E-CAD和FN翻譯水平的調節(jié)。
　　 4、體外GST-pulldown實驗驗證TWIST1與FLV12、FLV12與E-CAD的相互作

4、用關系。免疫共沉淀確認TWIST1與FLV12在體內的相互作用。
　　 5、雙熒光素酶報告系統分析TFF3對E-CAD啟動子活性的調節(jié)。
　　 6、干擾TWIST1表達建立穩(wěn)轉細胞系后,WesternBlot方法檢測結腸癌細胞中FLV12和E-CAD的表達。
　　 7、免疫組化檢測結腸癌中TFF3、TWIST1、FLV12蛋白表達,統計學分析三者與結腸癌病理學參數的相關性。
　　 結果:
　　 1

5、、成功構建原核表達載體pGEX-5X-1-TWIST1、pGEX-SX-1-FLV12和真核表達載體pGEFP-C1-FLg12、pcDNA3.1/HisA-FLV12、pcDNA3.1/HisA-TWIST1,建立HT29/SCR、HT29/si-1W穩(wěn)轉細胞系。
　　 2、TFF3在7株結腸癌細胞系中均有表達。淋巴結轉移灶細胞系SW620與原發(fā)灶細胞系SW480相比,TFF3、TWIST1、FN表達增強,E-CAD表達下降。

6、
　　 3、TFF3過表達,在轉錄水平,TWIST1,FLV12mRNA的表達上調;在翻譯水平,TWIST1、FLV12、FN表達增強,同時E-CAD表達下降。
　　 4、GSTopulldown、免疫共沉淀實驗證實TWIST1與FLV12在體外、體內均能相互作用,且在TFF3高表達狀態(tài)下相互作用增強。
　　 5、雙熒光素酶報告系統證實TFF3能夠抑制E-CAD啟動子活性。干擾TWIST1的表達,其抑制作用消除。

7、
　　 6、體外GST-pulldown實驗證實FLV12與E-CAD能夠相互作用,且TFF3能增強其互作。
　　 7、干擾TWIST1表達,FLVl2表達下調,E-CAD表達上調。
　　 8、免疫組化結果發(fā)現,TFF3、TWIST1、FLV12在結腸癌轉移灶的表達明顯高于其原發(fā)灶,且三者具有相關性。
　　 結論:
　　 1、TFF3通過TWIST1/FLV12下調結腸癌細胞系上皮細胞標志分子E-