1、目的：
　　急性前葡萄膜炎是葡萄膜炎中最常見的類型，為T細胞介導的免疫失衡所致的自身免疫性疾病。程序性死亡受體1（PD-1）是抑制活化T細胞的重要負向調(diào)控因子，在維持人體內(nèi)環(huán)境免疫平衡中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。本實驗收集大量急性前葡萄膜炎患者和健康人外周血中細胞的基因組DNA，對PD-1基因上SNP位點的多態(tài)性進行檢測分析，通過統(tǒng)計分析明確PD-1基因多態(tài)性與急性前葡萄膜炎的相關(guān)性。另外，建立急性前葡萄膜炎的動物模型，即實驗性自身免

2、疫性葡萄膜炎動物模型（experimental autoimmune uveitis,EAU），檢測脾臟和頸部淋巴結(jié)中PD-1和PD-L1基因在各個時間點mRNA的表達情況；同時，檢測急性前葡萄膜炎患者和健康人外周血單個核細胞中PD-1和PD-L1基因mRNA的表達水平，以及Th1細胞、Th2細胞、INF-γ+IL17+T細胞比例的變化情況，旨在了解免疫耐受調(diào)控信號通路中的PD-1/PD-L1在急性前葡萄膜炎中的作用。
　　方法：

3、
　　1.收集2015年3月到2016年12月于眼視光醫(yī)院就診的397例研究對象，其中
　　符合要求的急性前葡萄膜炎患者166例，以及健康對照組231例。通過Haploview軟件選取3個tagSNP分別為rs10204525、rs2227982、rs41386349參與本次的研究。采用限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）或測序的方法進行基因多態(tài)性的分型檢測。采用卡方檢驗或Fisher檢驗對兩組之間的等位基因和基因型的頻

4、率比較分析，P值采用Bonferroni矯正。
　　2.雄性 Lewis大鼠50只隨機分為實驗組和正常組。實驗組在皮下注射乳化的IRBP多肽（光感受器維生素A類結(jié)合蛋白）建立EAU動物模型。從免疫注射后的第一天開始觀察各組大鼠的眼部變化情況。分別檢測免疫后第8、11、14、17、20天五個時間點大鼠頸部淋巴結(jié)和脾臟中 PD-1、PD-L1、Foxp3、IFN-γ基因mRNA表達水平的改變。
　　3.本研究進一步檢測 PD-1

5、表達在急性前葡萄膜炎中的影響。收集2016年11月至2016年12月之間于眼視光醫(yī)院就診的符合要求的急性前葡萄膜炎患者12例并且同時收集了12例來院健康體檢者作為對照組。該部分實驗主要檢測內(nèi)容有：1）提取兩組被檢樣本外周血中單個核細胞的RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后通過熒光定量PCR的方法檢測免疫調(diào)控基因PD-1與PD-L1 mRNA的表達水平；2）采用流式細胞儀技術(shù)分別檢測了疾病組和健康對照組外周血中Th1細胞和IFN-γ+IL17+T細

6、胞比例的變化情況。
　　結(jié)果：
　　1.按照病例收集要求收集166例 AAU患者，231例健康對照者。經(jīng)對比分析AAU組和健康對照組之間3個SNP位點（rs10204525、rs2227982、rs41386349）的等位基因以及基因型頻率，發(fā)現(xiàn)rs10204525A>G中GG基因型在AAU患者中明顯高于正常人。rs2227982和rs41386349兩個SNP位點的等位基因和基因型頻率在急性前葡萄膜炎（AAU）和健康對照組

7、之間沒有明顯的差異。進一步在分層分析中，在HLA-B27陽性的急性前葡萄膜炎患者中，rs41386349的CC基因型明顯高于正常對照組；HLA-B27陰性的急性前葡萄膜炎患者中， rs2227982的TT基因型明顯高于正常對照組；rs2227982、rs41386349在HLA-B27陽性和陰性患者之間分布沒有差異；另外急性前葡萄膜炎不伴發(fā)強直性脊柱炎的患者中rs2227982的TT基因型明顯高于對照組，而CT基因型頻率明顯低于對照組；

8、與伴發(fā)強直性脊柱炎患者相比，不伴發(fā)強直性脊柱炎患者中rs2227982基因的CT基因型明顯降低；在女性中，可以發(fā)現(xiàn)rs2227982的TT基因型明顯高于對照組。
　　2.成功建立實驗性自身免疫性葡萄膜炎動物模型，在動態(tài)觀察中可以觀察到從免疫注射后的第八天開始眼部出現(xiàn)癥狀，第11天到第14天為眼部炎癥癥狀的高峰期，其后逐漸減輕，到第20天眼部癥狀基本消失。從熒光定量 PCR的結(jié)果可以看出模型組大鼠頸部淋巴結(jié)細胞和脾臟組織中，重要免疫

9、耐受調(diào)控基因PD-1、PD-L1 mRNA表達量明顯增加，F(xiàn)oxp3作為Treg細胞的轉(zhuǎn)錄因子在疾病初期mRNA表達量下降，后隨著PD-1、PD-L1的表達升高而上升。IFN-γmRNA則在疾病中的表達量明顯增高。
　　3.急性前葡萄膜炎患者和健康對照組的熒光定量 PCR的結(jié)果來看，PD-1基因的表達在患者組和健康對照組之間不明顯,而PD-L1 mRNA的表達顯著高于對照組，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.001）。流式細胞術(shù)結(jié)果：急性前

10、葡萄膜炎患者中，Th1細胞比例為（14.35±1.48）％，與對照組相比明顯升高；IFN-γ+IL17+T細胞比例為（0.22±0.03）%與對照組相比有顯著差異，具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論：
　　1.證實了PD-1的基因多態(tài)性與急性前葡萄膜炎相關(guān)。rs10204525的GG基因型是急性前葡萄膜炎患者的危險因素；而 rs41386349的CC基因型與HLA-B27陽性的急性前葡萄膜炎患者具有相關(guān)性，可能是導致發(fā)病的危險因素。

11、rs2227982與HLA-B27陰性或不伴發(fā)強直性脊柱炎的急性前葡萄膜炎有明顯的相關(guān)性；與伴發(fā)強制性脊柱炎AAU患者相比，不伴發(fā)強直性脊柱炎AAU患者中rs2227982的CT基因型頻率明顯減低，是該病的保護因素；在女性中， rs2227982的TT基因型可能是患者的保護性因素。
　　2.在動物實驗中可以發(fā)現(xiàn)PD-1、PD-L1 mRNA表達量的變化與實驗性自身免疫性葡萄膜炎的疾病進程基本一致。PD-1/PD-L1信號可以促使