1、目的：利用大腸桿菌系統(tǒng)表達重組人成纖維細胞生長因子-16(rhFGF16)，通過優(yōu)化表達以及純化條件，獲得可溶和包涵體兩種表達形式的高純度及高活性的重組hFGF16蛋白，并建立hFGF16蛋白的生物學活性檢測方法。此外，在細胞分子層面研究hFGF16蛋白促進H460 cells的增殖作用及其增殖的發(fā)生機制。
　　方法：從Gene Bank中篩選目的基因人FGF16，進行大腸桿菌偏好性優(yōu)化后并合成基因FGF16，經質粒擴增后與表達載

2、體pET-3d進行雙酶切連接，構建新的重組子 pET-3d-hFGF16。重組子經雙酶切和基因測序鑒定后，轉化至 E.coli BL21(DE3) pLysS感受態(tài)細胞中制備表達工程菌株，通過篩選以獲得穩(wěn)定性高的表達量較高的工程菌。通過優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)，調節(jié)目的蛋白的可溶性表達以及包涵體表達，其中包涵體部分經6M鹽酸胍變性后經一步逐滴稀釋至0M鹽酸胍緩沖液中，離心并收集沉淀，沉淀部分再次經8M脲進行變性，然后透析至4M脲緩沖液中，再依次

3、稀釋至2M脲緩沖液-0M脲緩沖液中，離心收集上清即為可溶蛋白?；趆FGF16蛋白等電點以及肝素親和性，建立了可溶性與包涵體兩種表達形式蛋白的純化方法。重組蛋白hFGF16經SDS-PAGE聯(lián)合Western blot鑒定后，利用MTT法檢測重組蛋白hFGF16對NIH3T3細胞的促增殖活性?；趤喖易宄蓡TFGF9能促進胚胎時期肺的發(fā)育以及肺支氣管的分化和肺相關癌癥的進程，建立了利用MTT法檢測hFGF16促進H460 cells增殖的

4、作用，同時通過Western blot篩選相關增殖信號通路，其中對經典的促細胞增殖的信號通路Akt以及 MAPK信號通路進行了驗證，并進一步引入了該信號通路中關鍵蛋白的抑制劑組分，通過MTT結合Western blot的檢測方法確定了hFGF16的促增殖作用機制。
　　結果：經大腸桿菌表達偏好性優(yōu)化的目的基因成功地導入至表達載體pET-3d中并構建重組表達質粒pET-3d-hFGF16，重組質粒轉化至E.coli BL21(DE3

5、) pLysS表達菌株中。通過優(yōu)化表達條件成功獲得可溶性和包涵體兩種表達形式的蛋白，包涵體部分經過兩次變性和復性處理獲得可溶蛋白，兩種存在于上清中的hFGF16蛋白，經陽離子交換層析柱和肝素親和層析柱純化得到的蛋白純度＞95％，其中可溶性形式蛋白收率約為130 mg/g，包涵體形式蛋白收率約為240 mg/g。細胞活性檢測證實，純化的重組蛋白能顯著地促進NIH3T3細胞的增殖，在3 ng/mL～100 ng/mL之間呈現(xiàn)劑量依賴性，且兩

6、種形式表達蛋白無明顯的統(tǒng)計學差異性。細胞實驗結果表明，hFGF16能促進NCl-H460 Cells的增殖并通過激活關鍵蛋白Akt和Erk1/2以及p38 MAPK的磷酸化來促進NCl-H460 cells的增殖作用。
　　結論：成功構建表達質粒pET-3d-hFGF16以及在E.coliBL21(DE3) pLysS中成功表達了具有高生物學活性和高純度的rhFGF16蛋白，并建立了可溶及包涵體兩種表達形式蛋白的純化方法及利用NI