1、CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T Cellls,Treg)是天然產(chǎn)生的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的重要亞群之一,在維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要的作用。近年來越來越多的證據(jù)證明,CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、腫瘤免疫監(jiān)測及自身免疫性疾病的發(fā)生中均發(fā)揮重要作用。但是機體內(nèi)天然的Treg細(xì)胞數(shù)目很少,在人體內(nèi),Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的5％～10%,而小鼠的只占1%～2%。因此,必須建立有效的T

2、reg細(xì)胞體外擴增方法,才能滿足大量的臨床輸注需要。
　　目前,普遍利用anti-CD3、CD28單克隆抗體和外源IL-2體外擴增Treg細(xì)胞,但其擴增效率很低,不能滿足臨床需求。此外,通過與DC的共培養(yǎng)也能達(dá)到擴增Treg細(xì)胞的效果。Treg細(xì)胞不僅在胸腺中產(chǎn)生,也可以在外周誘導(dǎo)生成。研究表明,TGF-β在Foxp3+誘導(dǎo)型Treg細(xì)胞(induced Treg,iTreg)的誘導(dǎo)、擴增和抑制功能中發(fā)揮了重要作用。本實驗應(yīng)用免疫

3、磁珠分離純化C57BL/6小鼠的CD4+CD25+T細(xì)胞,采用同基因及異基因不同種類的DC在體外擴增Treg細(xì)胞,通過流式細(xì)胞術(shù)和T細(xì)胞增殖抑制實驗檢測擴增前后Treg細(xì)胞表型和功能。
　　此外,本實驗采用TGF-β、IL-2和anti-CD3/CD28單克隆抗體誘導(dǎo)生成iTreg細(xì)胞,并驗證其表型和功能。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),MACS分離的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞純度達(dá)到93.57%,同基因和異基因DC都能有效刺激Treg細(xì)胞體外

4、擴增,其中同基因成熟DC擴增效果最為明顯。同基因成熟DC擴增后CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞純度達(dá)到94.16%,且高表達(dá)Foxp3分子。當(dāng)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與效應(yīng)T細(xì)胞比例為1∶1時,能夠有效的抑制效應(yīng)T細(xì)胞的增殖,而且,同基因成熟DC擴增的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制效果比新分離的Treg效果更好。
　　由此可見,同基因成熟DC能夠體外擴增表型和功能穩(wěn)定的Treg細(xì)胞。MACS分離純化的小鼠CD4+CD25

5、-T細(xì)胞低表達(dá)Foxp3分子,為17.62%,與Treg細(xì)胞功能相關(guān)的分子CTLA-4和CD62L表達(dá)也比較低,分別為1.37%和73.61%。經(jīng)TGF-β、IL-2和anti-CD3/CD28單克隆抗體體外誘導(dǎo)5天后,其Foxp3的表達(dá)上調(diào)至98.70%,而且其功能性分子CTLA-4和CD62L的表達(dá)也分別達(dá)到72.1%和87.51%。T細(xì)胞增殖抑制實驗結(jié)果表明,iTreg細(xì)胞與效應(yīng)T細(xì)胞比例為0.5∶1和1∶1時,能夠有效的抑制T細(xì)