1、目的：構建日本血吸蟲組織蛋白酶B(Sjcb2)原核表達載體pWR450-1/Sjcb2并表達；構建真核表達載體pcDNA3.1(+)/Sjcb2，轉染HeLa細胞，并將pcDNA3.1(+)/Sjcb2直接肌注BALB/c小鼠，觀察其所誘導的體液免疫和細胞免疫應答水平，初步研究該核酸疫苗對BALB/c小鼠誘導的免疫保護性作用，為研制新型抗日本血吸蟲感染核酸疫苗提供實驗依據。 方法：用PRIMER5.0引物設計軟件自行設計引物，P

2、CR法擴增Sjcb2基因片段，將PCR產物純化后與pUCm-T載體連接，經藍白斑篩選、雙酶切分析和PCR鑒定后，亞克隆入pWR450-1原核表達載體及pcDNA3.1(+)真核表達載體中，經抗生素(氨芐青霉素)篩選、雙酶切鑒定、PCR鑒定及測序鑒定后，將構建的pWR450-1/Sjcb2重組原核表達載體轉化大腸桿菌后經IPTG誘導表達，SDS-PAGE及Westernblotting鑒定表達情況。構建的pcDNA3.1(+)/Sjcb2

3、重組質粒電穿孔轉染HeLa細胞，免疫細胞化學法觀察其在真核細胞中的表達情況；將核酸疫苗pcDNA3.1(+)/Sjcb2注射到BALB/c小鼠后腿股四頭肌肌肉組織中，每2周免疫一次，共免疫3次。末次免疫后2周，用日本血吸蟲尾蚴攻擊感染BALB/c小鼠。PCR及免疫組化法分析Sjcb2基因在小鼠體內的穩(wěn)定性及表達情況；MTT法檢測小鼠脾淋巴細胞特異性增殖反應；ELISA雙抗體夾心法測定攻擊感染前后小鼠脾淋巴細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-

4、4的水平；瓊脂雙向擴散試驗測定小鼠血清中Sjcb2抗體水平；攻擊感染42天后剖殺小鼠，計算小鼠所荷成蟲對數及肝臟所荷蟲卵數。 結果：成功構建pWR450-1/Sjcb2重組原核表達載體，并在E.coliDH5α中表達出一分子量約為86KDa的重組融合蛋白；成功構建pcDNA3.1(+)/Sjcb2真核表達重組體，電穿孔轉染HeLa細胞，免疫細胞化學法表明Sjcb2能在HeLa細胞胞漿中表達。將核酸疫苗pcDNA3.1(+)/Sj

5、cb2免疫BALB/c小鼠后，提取小鼠后腿股四頭肌的總DNA并用PCR擴增，疫苗組結果顯示在第一次免疫后第1、3、7、10、14天、第二次免疫后14天及第三次免疫后14、28天均可檢測到Sjcb2基因的存在，pcDNA3.1(+)/Sjcb2核酸疫苗在小鼠肌肉組織或細胞中能長期穩(wěn)定存在。用免疫組化法檢測該基因的表達，結果顯示疫苗組小鼠的肌細胞中有散在的陽性顆粒。免疫后小鼠抗體檢測顯示DNA疫苗組小鼠在第一次免疫后7天開始出現(xiàn)抗體，第14

6、天達高峰。脾細胞培養(yǎng)MTT法檢測細胞增殖，結果顯示DNA疫苗組脾細胞在SWAP或PHA刺激時顯著高于pcDNA3.1組和生理鹽水組(P＜0.05)。于攻擊感染前后剖殺小鼠，進行脾細胞培養(yǎng)上清的細胞因子檢測，結果顯示攻擊感染前DNA疫苗組IFN-γ在SWAP或PHA刺激時顯著高于pcDNA3.1組和生理鹽水組(P＜0.05)，攻擊感染后仍維持較高水平；而攻擊感染前DNA疫苗組分泌IL-4的水平與pcDNA3.1組和生理鹽水組無顯著性差異(

7、P＞0.05)，攻擊感染后，DNA疫苗組與pcDNA3.1組和生理鹽水組仍無顯著性差異，但與攻擊感染前比較則有增高(P＜0.05)，并以pcDNA3.1組和生理鹽水組增高比較明顯。小鼠肝臟荷蟲卵數結果顯示pcDNA3.1(+)/Sjcb2核酸疫苗免疫組與pcDNA3.1組及生理鹽水組小鼠的肝臟蟲卵數之間均有顯著性差異(P＜0.05)，而pcDNA3.1組與生理鹽水組小鼠蟲卵數之間無顯著性差異(P＞0.05)；小鼠所荷成蟲對數結果提示pc

8、DNA3.1(+)/Sjcb2核酸疫苗免疫組與pcDNA3.1組及生理鹽水組小鼠之間所荷成蟲數均有顯著性差異(P＜0.05)，而pcDNA3.1組與生理鹽水組之間無顯著性差異(P＞0.05)。計算減卵率和減蟲率，減卵率為60.61％，減蟲率為36.32％。 結論：成功擴增日本血吸蟲組織蛋白酶B(Sjcb2)基因，構建了pWR450-1/Sjcb2原核表達載體，并于大腸桿菌中表達；構建了pcDNA3.1(+)/Sjcb2真核表達重