1、肝臟作為一個天然免疫器官，包含了眾多的天然免疫細胞，如巨噬細胞、NK細胞和NKT細胞。這些細胞大量聚集在肝臟中，表明它們在肝臟生物學中具有重要的地位，能夠為機體提供抵御腫瘤和外來抗原入侵的免疫監(jiān)視及保護。但是近年來的研究表明過度的免疫細胞活化有時可能對肝細胞進行意想不到的自身攻擊，引起自身免疫性的肝臟損傷。Kupffer細胞被細菌的外毒素(LPS)活化后能分泌大量的炎性細胞因子介導肝臟損傷；NKT細胞被刀豆蛋白A(ConA)和α-半乳糖

2、神經酰胺(α-Galcer)激活后通過分泌細胞因子和直接殺傷肝實質細胞導致肝臟嚴重的損傷。NK細胞同樣是肝臟中重要的天然免疫細胞，占肝臟淋巴細胞總數(shù)的30％-40％。很多研究提示NK細胞參與了人類肝炎發(fā)病的過程，在小鼠模型的研究中也發(fā)現(xiàn)NK細胞過度活化會導致肝臟損傷，但是NK細胞通過哪些機制介導肝臟損傷尚未研究清楚。 本研究通過給小鼠同時注射poly I：C(1ug/只)和D-GaIN(10mg/只)，建立了一種比較新的爆發(fā)性肝

3、炎的模型，有利于深入探討肝臟天然免疫細胞在肝臟免疫損傷中的作用及機理。我們采用賴氏法檢測血清轉氨酶ALT水平、組織H-E染色觀察肝臟病理學變化，并利用上述指標綜合評估肝細胞損傷程度；通過細胞清除研究特定淋巴細胞群在肝臟損傷過程中的作用；采用流式細胞術測定各淋巴細胞亞群的表型，活化狀態(tài)以及細胞因子分泌功能；用ELISA法和實時定量PCR法檢測肝臟中、血清中以及細胞培養(yǎng)上清中細胞因子的表達水平；我們用MACS磁珠分離方法分離純化肝臟中的NK

4、細胞和Kupffer細胞，并且在體外poly I：C刺激下共同培養(yǎng)，同時在體內和體外運用特異抗體中和實驗觀察NK細胞和Kupffer細胞間相互作用的分子機制。通過上述研究方法取得的結果如下： 1.poly I：C能夠在D-GaIN鼠中引起嚴重的肝臟損傷 D-GalN致敏的小鼠接受poly I：C注射后爆發(fā)嚴重的肝臟損傷。聯(lián)合注射18小時后肝臟轉氨酶水平可以達到14560±2910 IU/L，直到48小時才基本恢復到正常

5、水平。通過HE染色可以看到poly I：C和D-GalN聯(lián)合注射鼠肝臟有局部充血和肝細胞的壞死。這種嚴重的肝損傷現(xiàn)象只在poly I：C和D-GalN聯(lián)合注射鼠中可見，單獨注射poly I：C或者D-GalN都不會引起小鼠轉氨酶的升高和肝臟的壞死。而且poly I：C/D-GalN誘導的損傷是肝臟特異性的，小鼠的肺臟、結腸和小腸都沒有明顯的損傷。 2.poly I：C和D-GaIN誘導的爆發(fā)性肝損傷是NK細胞介導的 流式

6、細胞檢測結果表明，poly I：C/D-GalN能夠誘導大量的NK細胞在肝臟局部聚集，而且這些NK細胞活化程度增強，表現(xiàn)在細胞表面CD69分子表達水平升高。體內清除NK細胞后，poly I：C/D-GalN誘導的肝臟損傷明顯降低。Poly I：C/D-GalN同樣能夠在SCID鼠中引發(fā)嚴重的肝臟損傷，這一結果進一步證明了NK細胞是該模型中導致肝臟損傷的重要效應細胞，而且其發(fā)揮作用時不依賴T細胞和B細胞的協(xié)助。 3.在poly I

7、：C和D-GalN聯(lián)合注射小鼠中NK細胞的活化依賴Kupffer細胞的存在 由脂質體介導的巨噬細胞清除實驗表明，poly I：C和D-GalN聯(lián)合注射誘導的肝臟損傷是依賴Kupffer細胞的。Kupffer細胞被清除后，poly I：C/D-GalN不能夠引起血清中轉氨酶水平的急劇升高。和Kupffer細胞未清除小鼠相比，polyI：C/D-GalN注射后，肝臟中NK細胞的比例降低，分泌IFN-γ的NK細胞也明顯減少。

8、4.NK細胞分泌的IFN-γ和Kupffer細胞分泌的TNF-α仿同誘導肝臟損傷ELISA檢測結果顯示，poly I：C/D-GalN注射后，血清中IFN-γ和TNF-α的量顯著增多，在18小時達到頂峰，48小時回復到正常水平，這和轉氨酶的變化是一致的。而定量PCR的結果表明，在肝臟局部，IFN-γ的RNA轉錄水平2小時就開始升高，4小時到峰值，24小時回復到正常水平；TNF-α RNA的轉錄水平則在2小時就可以達到峰值，48小時回落到

9、正常值。中和體內的TNF-α后，poly I：C/D-GalN誘導的肝臟損傷明顯減弱。給IFN-γ缺陷鼠注射poly I：C/D-GalN后，血清中轉氨酶的水平較野生型鼠也顯著降低。表明IFN-γ和TNF-α在該模型中參與了肝臟損傷的形成。給予外源性重組IFN-γ的實驗表明，D-GalN能夠使肝臟對IFN-γ造成的損傷更加敏感。而且給D-GalN致敏鼠注射IFN-γ和TNF-α時，兩種細胞因子同時注射誘導的肝臟損傷遠大于單獨注射其中一種

10、細胞因子引發(fā)的損傷，表明IFN-γ和TNF-α在介導肝臟損傷時有協(xié)同效應。 另外，胞內細胞因子染色實驗證明，IFN-γ主要是由肝臟中的NK細胞分泌的，和T細胞、NKT細胞無關。當用抗體將NK細胞清除后，poly I：C/D-GalN誘導的IFN-γ水平就顯著降低；而免疫熒光染色實驗則證明TNF-α主要是由肝臟中的Kupffer細胞分泌的，清除Kupffer細胞后可以明顯降低血清中TNF-α的含量。 5.活化后的NK細胞和

11、Kupffer細胞通過NKG2D/Rae1相互作用 通過RT-PCR方法對poly I：C/D-GalN注射后肝臟組織的檢測，我們發(fā)現(xiàn)NKG2D的配體Rae1轉錄水平升高，另一個配體Mult1的RNA轉錄水平基本沒有變化。進一步的流式結果證明了poly I：C/D-GalN注射后，肝臟中Kupffer細胞表達Rael，NK細胞表面的NKG2D表達沒有變化。阻斷小鼠體內NKG2D通路后，poly I：C/D-GalN誘導的肝臟損傷

12、明顯減弱，血清中IFN-γ的含量也顯著降低。體外純化的NK細胞和Kupffer細胞共同培養(yǎng)實驗進一步證明了Kupffer細胞依賴NKG2D和Rae1的識別促進NK細胞分泌IFN-γ。 6.IL-12和IL-18也參與了NK細胞和Kupffer細胞之間的相互作用 ELISA實驗顯示poly I：C/D-GalN能夠誘導肝臟局部和血清中IL-12和IL-18的表達水平升高，在注射后12小時和18小時明顯高于0小時，提示IL

13、-12和IL-18可能參與了肝臟損傷的過程。體外NK細胞和Kupffer細胞共培養(yǎng)實驗進一步證明，分別中和IL-12和IL-18后，poly I：C刺激產生的IFN-γ明顯降低，預示IL-12和IL-18在NK細胞和Kupffer細胞的相互作用中起到了積極的作用。 結論：本文描述了一個NK細胞介導的小鼠爆發(fā)性肝炎模型，這對于已經存在的巨噬細胞介導的肝炎模型和NKT細胞介導的肝炎模型是個很好的補充。同時，本文首次描述了肝臟中的NK