1、目的：利用流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)RNA干擾技術(shù)沉默STAT3基因表達(dá)前后肺腺癌A549細(xì)胞的細(xì)胞周期狀況和細(xì)胞凋亡水平變化，探討（1）STAT3基因表達(dá)在肺腺癌A549細(xì)胞增殖生長(zhǎng)中的作用；（2）STAT3是否介導(dǎo)A549細(xì)胞周期的進(jìn)展；（3）STAT3與A549細(xì)胞的凋亡是否有密切關(guān)系。 方法：（1）STAT3siRNA的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染：①?gòu)腃NKI上搜索人的STAT3mRNA全基因序列，將搜索的所有序列利用BLAST軟件進(jìn)行同

2、源性分析。②將比對(duì)好的STAT3mRNA全基因序列作為模版，從基因編碼區(qū)起始密碼子下游尋找符合設(shè)計(jì)特征的靶序列，根據(jù)siRNA的設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)三段表達(dá)STAT3特異shRNA的基因序列。⑧按照設(shè)計(jì)的序列，采用化學(xué)合成的方法合成三條雙鏈siRNA，分別為STAT3siRNA-1、STAT3siRNA-2、STAT3 siRNA-3，同時(shí)設(shè)立Non-Control陰性對(duì)照組，Non-Control-FAM熒光對(duì)照組及空白組。④采用脂質(zhì)體介導(dǎo)

3、方法將siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，并利用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況，估計(jì)轉(zhuǎn)染效率，篩選最佳轉(zhuǎn)染濃度。（2）AM-BLUE法測(cè)定RNA干擾的抑制率：于轉(zhuǎn)染24h、48h、72h分別加入AM-BLUE孵育4-6h，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)光吸收值，計(jì)算出抑制率。（3）FCM檢測(cè)STAT3基因沉默前后肺腺癌A549細(xì)胞的細(xì)胞周期狀況和細(xì)胞凋亡水平：①于轉(zhuǎn)染24h、48h、72h收集細(xì)胞，將細(xì)胞固定后，進(jìn)行PI染色，利用FCM檢測(cè)細(xì)胞周期的變化。②于轉(zhuǎn)

4、染24h、48h、72h收集細(xì)胞，利用AnnexinⅤ聯(lián)合PI法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡。 結(jié)果：（1）成功設(shè)計(jì)并化學(xué)合成siRNA，成功轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，并根據(jù)轉(zhuǎn)染效率篩選出最佳轉(zhuǎn)染濃度；（2）AM-BLUE法檢測(cè)結(jié)果顯示RNA干擾的抑制率于轉(zhuǎn)染后24h即可出現(xiàn)，48h抑制率較24h有明顯上升（P<0.05），72h的抑制率較48h上升不顯著（P>0.05）。表明48h后抑制率進(jìn)入穩(wěn)定階段。對(duì)應(yīng)不同靶點(diǎn)的三條STAT3siRNA均可抑制

5、A549細(xì)胞增殖，且三者抑制率差別不顯著（P>0.05）；（3）利用FCM檢測(cè)到STAT3siRNA肺腺癌A549細(xì)胞大量處于G0/G1期，而S，G2/M期的細(xì)胞相對(duì)減少。提示細(xì)胞未能進(jìn)入S期完成DNA的合成，無(wú)法進(jìn)入分裂期，細(xì)胞周期被阻斷。（4）利用FCM檢測(cè)RNA干擾后A549細(xì)胞凋亡明顯增多，前48h增幅明顯（P<0.05），48h后增幅趨于平穩(wěn)（P>0.05），但仍能較長(zhǎng)時(shí)間維持較高水平，干擾各組A549細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯差異（P

6、>0.05）。 結(jié)論：（1）本實(shí)驗(yàn)利用基因重組技術(shù)，針對(duì)STAT3基因編碼區(qū)，成功合成發(fā)夾狀小干擾RNA（siRNA），并將其成功轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞中；（2）利用AM-BLUE法檢測(cè)siRNA干擾前后A549細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)，說(shuō)明siRNA能有效地抑制A549細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)，STAT3作為治療肺癌的靶點(diǎn)是可行的，我們選擇沉默STAT3的位點(diǎn)是有效的，siRNA的構(gòu)建是成功的；（3）利用FCM檢測(cè)siRNA干擾前后A549細(xì)胞的細(xì)胞周期