1、目的：研究RNAi技術(shù)對(duì)人肺癌A549細(xì)胞系中STAT3基因的阻斷效應(yīng)，應(yīng)用熒光定量PCR法和Western-blot（蛋白免疫印跡法）檢測(cè)干擾前后STAT3的表達(dá)情況，探討STAT3在肺癌發(fā)病機(jī)制中的作用，為肺癌的治療尋找新的靶點(diǎn)。方法：（1）化學(xué)合成siRNA并轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞：①以肺癌A549細(xì)胞作為靶細(xì)胞，STAT3基因作為靶基因，從CNKI上搜索STAT3mRNA全基因序列，BLAST軟件進(jìn)行同源性分析，以STAT3mRNA全

2、基因序列作為模板，從基因編碼區(qū)起始密碼子下游尋找符合設(shè)計(jì)特征的靶序列，根據(jù)siRNA的設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)三段表達(dá)STAT3特異shRNA的基因序列，采用化學(xué)合成法合成三條雙鏈siRNA，分別命名為sihSTAT3-1、sihSTAT3-2、sihSTAT3-3。將實(shí)驗(yàn)分為siRNA1組、siRNA2組、siRNA3組、sihGAPDH陽性對(duì)照組，NControl陰性對(duì)照組及A549細(xì)胞空白對(duì)照組。②采用脂質(zhì)體介導(dǎo)方法，將合成siRNA轉(zhuǎn)染各

3、組細(xì)胞，16小時(shí)后熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況，觀察轉(zhuǎn)染效率。（2）熒光定量PCR法檢測(cè)RNA干擾后STAT3mRNA抑制率：①以靶基因STAT3為目的基因、管家基因β-actin為內(nèi)參基因。轉(zhuǎn)染24h后收集細(xì)胞，用TRIZOL法提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)目的條帶。②于轉(zhuǎn)染24h、48h、72h分別收集細(xì)胞，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）獲得靶基因STAT3及管家基因β-actin的cDNA產(chǎn)物，并作為標(biāo)準(zhǔn)品梯度

4、稀釋，采用SYBR GreenⅠ定量PCR檢測(cè)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線，溶解曲線及擴(kuò)增曲線。⑧采用相對(duì)定量比較域值法計(jì)算STAT3mRNA相對(duì)表達(dá)倍數(shù)，得出抑制率，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。（3）應(yīng)用Western-blot法檢測(cè)干擾后STAT3蛋白表達(dá)抑制率：①選擇一干擾效率較高siRNA對(duì)各組中的STAT3蛋白進(jìn)行Western-blot檢測(cè)，用Bradford比色法測(cè)定蛋白含量、聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、考馬斯亮藍(lán)染色觀察蛋白條帶、電轉(zhuǎn)

5、移（electrotransfer）封閉PVDF膜、免疫反應(yīng)（加入一抗和二抗）、化學(xué)發(fā)光顯示目的條帶。②將Western-blot結(jié)果掃描傳送至計(jì)算機(jī)，用Image-Proplus圖像分析軟件系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析，以蛋白條帶的灰度值代表蛋白的表達(dá)量，用β-actin條帶灰度值進(jìn)行校正，得出各條帶的相對(duì)灰度值。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果。結(jié)果：（1）成功設(shè)計(jì)合成siRNA，并成功轉(zhuǎn)染肺癌A549細(xì)胞。（2）熒光定量PCR結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染24h、48

6、h、72h后，各干擾組與空白組比較STAT3基因表達(dá)量明顯下調(diào)（P<0.05），siRNA-STAT3對(duì)STAT3基因的表達(dá)均抑制，其中0到48小時(shí)抑制率呈明顯上升趨勢(shì)，48小時(shí)到72小時(shí)抑制率變化不明顯。對(duì)應(yīng)不同位點(diǎn)的三個(gè)siRNA-STAT3對(duì)STAT3mRNA表達(dá)的抑制率無明顯差異（P>0.05）；陰性對(duì)照及空白對(duì)照STAT3表達(dá)量無明顯差異（P>0.05）。（2）Western blot顯示：轉(zhuǎn)染前后STAT3蛋白的表達(dá)水平明顯

7、受到抑制，抑制率為76.92%，具有顯著差異（P<0.05），內(nèi)參基因在各組的表達(dá)量無明顯差異。結(jié)論：（1）本實(shí)驗(yàn)利用化學(xué)合成法成功合成了針對(duì)STAT3基因的siRNA，成功建立了STAT3基因RNA干擾技術(shù)。（2）將合成的siRNA轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞后，通過熒光定量PCR檢測(cè)STAT3基因表達(dá)量，和通過Western-blot檢測(cè)STAT3蛋白表達(dá)量，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染后STAT3mRNA及蛋白表達(dá)量均明顯受到抑制，而對(duì)內(nèi)參基因的表達(dá)影響