1、香茶菜屬植物在我國(guó)種類繁多,分布廣泛,從香茶菜屬中提取出的多種化合物,以其高效低毒的作用亦廣泛應(yīng)用于抗腫瘤的治療,而對(duì)映-貝殼杉烷二萜類化合物是香茶菜屬植物中含量最為廣泛,特征最為典型化合物,研究證實(shí),該化合物具有抗炎、抗菌、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等多重生物活性,在抗腫瘤活性方面已呈現(xiàn)出相當(dāng)大的潛力。近年來(lái),從冬凌草中分離得到的對(duì)映-貝殼杉烷類二萜冬凌草甲素(Oridonin)在治療白血病方面有突破性的進(jìn)展,并以進(jìn)入臨床治療階段,而類似分子結(jié)

2、構(gòu)的對(duì)映-貝殼杉烷二萜類化合物的抗白血病細(xì)胞株的相關(guān)研究報(bào)道卻很少,大都通過(guò)凋亡通路來(lái)對(duì)二萜化合物抗腫瘤機(jī)制做一初步探究。Leukamenin E是從甘肅產(chǎn)擬缺香茶菜中分離得到的對(duì)映-貝殼杉烷型二萜化合物,研究顯示該化合物該化合物有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性,但其抗癌活性的機(jī)理卻仍不明確,尚需進(jìn)一步研究。目前,有關(guān)Leukamenin E對(duì)白血病細(xì)胞骨架的影響研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。
　　本論文以對(duì)映-貝殼杉烷二萜類化合物L(fēng)eukamenin E

3、為受試藥物,以人早幼粒白血病HL-60細(xì)胞為處理對(duì)象,分別利用MTT法和臺(tái)盼藍(lán)排染法檢測(cè)了該藥物作用下HL-60細(xì)胞的活性及其對(duì)HL-60細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的作用,并對(duì)該藥物對(duì)細(xì)胞周期的影響及誘導(dǎo)凋亡的情況進(jìn)行了研究,同時(shí),通過(guò)對(duì)核的染色以及制備分裂中期染色體觀察細(xì)胞核及細(xì)胞的變化,最后,利用間接免疫熒光和熒光染色法,對(duì)細(xì)胞骨架微絲、微管及波形蛋白的影響進(jìn)行觀察,進(jìn)一步探究該化合物的作用機(jī)理。主要結(jié)果如下:
　　1. Leukameni

4、n E對(duì)HL-60細(xì)胞有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性,表現(xiàn)為低濃度條件下抑制細(xì)胞生長(zhǎng),高濃度條件下具有致死作用,存在時(shí)間-劑量效應(yīng)。MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性結(jié)果顯示,該化合物作用HL-60細(xì)胞的IC50=0.89±0.15μmol/L。
　　2.隨著Leukamenin E藥物濃度的增加,該化合物顯著地影響了HL-60細(xì)胞周期的分布,引起了顯著的細(xì)胞S期阻滯,抑制細(xì)胞生長(zhǎng),進(jìn)而產(chǎn)生凋亡。
　　3.利用熒光染料Hoechst33258對(duì)細(xì)胞進(jìn)行

5、染色后結(jié)果顯示,該化合物可以引起HL-60細(xì)胞趨向多核形成。
　　4.對(duì)Leukamenin E作用的細(xì)胞進(jìn)行了染色體的統(tǒng)計(jì),發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目隨著濃度的增加大量增多,出現(xiàn)染色體數(shù)目為86~118個(gè)的分裂期細(xì)胞,形成多倍體細(xì)胞(染色體數(shù)目≥80條)。
　　5.通過(guò)間接免疫熒光對(duì)細(xì)胞微絲骨架進(jìn)行染色并利用激光共聚焦觀察,發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的增加,微絲隨之變化,當(dāng)較高濃度(2.1~2.7μmol/L)作用時(shí),細(xì)胞周圍紅色亮環(huán)斷開,細(xì)胞

6、內(nèi)顆粒狀熒光增強(qiáng),聚集成團(tuán)。同時(shí),觀察到有凋亡小體形。
　　6.通過(guò)間接免疫熒光對(duì)細(xì)胞微管骨架進(jìn)行染色并利用激光共聚焦觀察,隨著藥物濃度的增多,微管蛋白明顯增多且都呈現(xiàn)不規(guī)則狀細(xì)絲結(jié)構(gòu)或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),當(dāng)藥物濃度≥2.4μmol/L時(shí),微管蛋白分布密度大量增大,極不均勻,出現(xiàn)密集、紊亂的纖維束,毫無(wú)規(guī)則完全覆蓋在細(xì)胞表面,呈濃度依賴性,與對(duì)照組相比,變化十分明顯。
　　7.通過(guò)間接免疫熒光對(duì)細(xì)胞波形蛋白進(jìn)行染色并用免疫熒光顯微鏡觀

7、察,隨著濃度的增加,與對(duì)照相比,細(xì)胞內(nèi)出的現(xiàn)聚集斑塊變大熒光變亮,出現(xiàn)聚集斑塊的細(xì)胞開始增多,并且呈現(xiàn)高亮熒光團(tuán)。
　　總之,Leukamenin E對(duì)人早幼粒白血病細(xì)胞有較強(qiáng)的毒性,作用于HL-60細(xì)胞后,抑制細(xì)胞生長(zhǎng),引起顯著的S期阻滯,并伴有凋亡產(chǎn)生,并具有時(shí)間-劑量效應(yīng)。同時(shí),該化合物還可以使細(xì)胞產(chǎn)生多核,引起多倍體細(xì)胞產(chǎn)生;同時(shí), HL-60細(xì)胞經(jīng)化合物處理后,對(duì)細(xì)胞內(nèi)微絲影響較小,但微管蛋白明顯增加,而波形蛋白纖維則出