1、白血病是最常見的惡性腫瘤之一,是一組異質(zhì)性起源的惡性克隆性疾病,年發(fā)病率3-4/10萬.目前治療白血病的方法主要是化療,化療主要是通過促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡來達(dá)到治療白血病的目的.隨著化療方案的不斷改進(jìn)和新化療藥物的出現(xiàn),白血病的預(yù)后已有非常明顯的改善,但仍然存在白血病耐藥及停藥后白血病復(fù)發(fā)等問題.例如,多種腫瘤細(xì)胞可對抗腫瘤藥物諸如長春新堿(VCR)、絲裂霉素C(MMC)和柔紅霉素(DAM)等產(chǎn)生耐藥性.因此,尋找抗腫瘤新藥、探索相關(guān)治療

2、新方案具有重要意義. 近年來,某些中藥及其有效組分因具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用備受關(guān)注.雷公藤泛指衛(wèi)矛科雷公藤屬植物,是我國傳統(tǒng)中藥材之一.雷公藤紅素是雷公藤單體之一,屬三萜類色素,分子式為C29H3804,分子量為450.有文獻(xiàn)報道,雷公藤紅素不僅具有免疫抑制和抗炎作用,也可顯示體外抗腫瘤活性,但其機制尚未完全明了.本研究以人急性髓系白血病HL-60細(xì)胞為靶細(xì)胞,采用流式細(xì)胞術(shù)和透射電鏡法等方法,探討了雷公藤紅素誘導(dǎo)HL-60

3、細(xì)胞凋亡的量效及時效關(guān)系,此外還檢測了雷公藤紅素處理前后對HL-60細(xì)胞Fas、FasL和INF-κBP65表達(dá)水平的影響,以期了解雷公藤紅素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用機制. 材料和方法: 1.HI-60細(xì)胞培養(yǎng)及處理: 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔接種1×10<'6>/ml的HL-60細(xì)胞,37℃、5﹪CO<,2>條件下預(yù)培養(yǎng)24 h.試驗組加入終濃度分別為0.5、1.0、1.5和2.0/μmol/L的雷公藤紅素,實驗中

4、同時設(shè)置不加藥物的對照組,37℃、5﹪CO<,2>培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞.另將HI,-60細(xì)胞與終濃度為1.5μmol/L雷公藤紅素分別培養(yǎng)0、4、8、12、16、24 h.所收集的細(xì)胞用PBS洗滌2次后重懸,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10<'6>/ml. 2.腫瘤細(xì)胞殺傷試驗采用臺盼蘭染色活細(xì)胞計數(shù)法.取30μl不同濃度雷公藤紅素處理前后細(xì)胞懸液,用臺盼藍(lán)染色后鏡檢100個細(xì)胞并計算活細(xì)胞百分率,其中拒染細(xì)胞為活細(xì)胞,染成藍(lán)色的細(xì)胞為

5、死細(xì)胞. 3.腫瘤細(xì)胞凋亡檢測采用FiTC-annexin V/PI流式細(xì)胞法.取上述不同濃度雷公藤紅素處理及同一濃度雷公藤紅素作用不同時間的HL60細(xì)胞懸液100μl,分別加入10μlFITC-annexin V,37℃孵育10 min,PBS洗滌后重懸細(xì)胞,加入PI終止液50μl,用流式細(xì)胞儀檢測. 4.透射電鏡觀察取1.5 ℃mol/L雷公藤紅素處理0和24 h的細(xì)胞離心后棄上清,沉淀用預(yù)冷的0.01 mol/L

6、PBS(pH 7.4)離心洗滌細(xì)胞2次,2.5﹪戊二醛磷酸緩沖液4℃固定細(xì)胞4 h,超薄切片后用透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化. 5.Fas和FasL檢測分別取1.5μmol/L雷公藤紅素處理0、12和24 h的細(xì)胞懸液100μl,分別加入FITC標(biāo)記的Fas或FasL單克隆抗體10μl,以IgGl-FITC為陰性對照,37℃孵育30 min后用流式細(xì)胞儀檢測,分別定量分析不同標(biāo)本中Fas和FasL陽性細(xì)胞百分率. 6.NF

7、-κBP65活性的檢測分別取1.5μmol/L雷公藤紅素處理0、12和24 h的細(xì)胞懸液100μl,加入兔抗人NF-κBP65單克隆抗體100μl,室溫孵育30 min后用PBS洗滌2次,然后加入FITC標(biāo)記鼠抗兔單克隆抗體,室溫避光孵育30 min,PBS洗滌2次,用1﹪副醛固定細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀檢測,定量分析不同標(biāo)本中NF-κBP65陽性細(xì)胞百分率. 結(jié)果: 1.不同藥物濃度及作用時間與細(xì)胞凋亡率變化的關(guān)系臺盼藍(lán)染色

8、結(jié)果表明,0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μmol/L雷公藤紅素作用24 h后,HL-60活細(xì)胞百分率分別為93.1±1.4、92.1±1.1、86.4±1.4、84.1±1.7、80.2±1.5,未受雷公藤紅素作用的正常HL-60活細(xì)胞百分率為98.3±0.6.流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明,HL-60細(xì)胞凋亡率分別為6.13±0.83、14.31±1.35、36.71±2.28、31.85±2.06、20.17±2.19,與對照組1

9、.97±0.64相比其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05).其中藥物濃度為0.5～1.5 μmol/L時,細(xì)胞凋亡率隨藥物濃度的增加而升高,藥物濃度≥2.0 μmol/L時,細(xì)胞凋亡率隨藥物濃度增加而下降.1.5μmol/L雷公藤紅素分別作用4、8、12、16、24 h時,其凋亡率分別為2.67±0.26、7.44±0.66、12.68±1.15、22.10±0.95、38.53±1.83,與對照組1.92±0.26相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P

10、<0.05). 2.細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果正常HL-60細(xì)胞呈較為均一的圓形或橢圓形.1.5 μmol/L,雷公藤紅素分別處理16和24 h后,均可見細(xì)胞圓縮、大量胞漿內(nèi)空泡,并出現(xiàn)染色體邊集、細(xì)胞核形成新月體形等典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化,部分細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)凋亡小體,隨作用時間延長上述病變更為明顯. 3.Fas、Fasl,和NF-KBP65陽性細(xì)胞百分率1.5μmol/L雷公藤紅素分別作用12和24h后,HL-60細(xì)胞Fa

11、s和FasL表達(dá)明顯增強,其中Fas陽性細(xì)胞百分率分別為47.91±1.21、65.74±1.20,與對照組14.23±1.42相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);FasL陽性細(xì)胞百分率分別為37.92±1.73、43.50±2.11,與對照組15.61±1.10相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05).1.5/μmol/L雷公藤紅素作用24 h時,NF-KBP65陽性HL-60細(xì)胞率為4.78±0.30,與對照組8.34±1.52相比,

12、明顯低于對照組(P<0.05). 結(jié)論: 1.雷公藤紅素在一定的濃度范圍內(nèi)(0.5～1.5μmol/L),均可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡并呈濃度依賴效應(yīng),且藥物濃度為1.5μmol/L時細(xì)胞凋亡率最高.當(dāng)雷公藤紅素濃度≥2.0/μmol/L時,HL-60細(xì)胞凋亡率不升反降,提示雷公藤紅素作用HL60細(xì)胞時,可能存在有效濃度閾值現(xiàn)象.當(dāng)雷公藤紅素濃度為1.5μmol/L時,HL-60細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)作用時間依賴效應(yīng). 2