1、目的與意義 花生四烯酸(arachdonicacid，AA)是生物體內(nèi)最豐富的物質(zhì)之一，是體內(nèi)多種重要活性物質(zhì)的來源，主要是以酯化的形式結(jié)合在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的脂肪酸上，在脂解激素刺激時由磷脂酶A2水解釋放至細(xì)胞漿內(nèi)。對AA的研究已有多年，最為人們熟知的是環(huán)氧化酶和脂質(zhì)氧化酶代謝途徑，近年研究發(fā)現(xiàn)AA還可通過細(xì)胞色素P450途徑代謝(即AA代謝的第三條途徑)，包括花生四烯酸細(xì)胞色素P450表氧化酶(AAcytochromeP450ep

2、oxygenase，CYP)途徑和ω-羥化酶途徑，其中AA經(jīng)表氧化酶代謝產(chǎn)生四種EETs(5，6-，8,9-，11，12-和14,15-EET)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在哺乳動物有14個家族和26個亞族，而在人類僅發(fā)現(xiàn)有CYP2C和CYP2J表達(dá)。CYP在體內(nèi)廣泛分布，尤其在肝臟中表達(dá)最豐富，主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，在血管中亦存在表達(dá)；目前已發(fā)現(xiàn)并克隆2J家族的9個基因，其中在人類僅發(fā)現(xiàn)了2J2，其在心臟和血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)最豐富，我們和國外學(xué)者已經(jīng)

3、發(fā)現(xiàn)EETs在調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用，EETs可以通過激活鈣離子敏感的鉀通道，使平滑肌細(xì)胞處于超極化狀態(tài)而擴張血管調(diào)節(jié)血壓，還參與調(diào)節(jié)炎癥、細(xì)胞遷移、細(xì)胞凋亡、血小板聚集和保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞。 我們的研究首次證實表氧化酶基因在不同的人類腫瘤組織中以及腫瘤細(xì)胞系中選擇性高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染CYP2J2和外源性EETs通過激活MAPK、PI3K/AKt、及EGFR途徑促進(jìn)腫瘤的惡性增殖；通過上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-x

4、L、下調(diào)凋亡蛋白Bax來保護(hù)腫瘤細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果表明CYP2J2在人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。然而CYP和EETs在人類腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用及其機制如何，花生四烯酸表氧化酶抑制劑在腫瘤的防治中有何意義呢? 本研究通過對雌激素受體陰性、高轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-435s)給予重組腺相關(guān)病毒(recombinantadeno-associatedvirus，rAAV)介導(dǎo)的表氧化酶基因轉(zhuǎn)染，探討其對腫瘤轉(zhuǎn)移的影響以及

5、相關(guān)機制；試驗了花生四烯酸表氧化酶抑制劑(17-ODYA)對裸鼠移植瘤的抑瘤效應(yīng)。 方法與結(jié)果 1.培養(yǎng)MDA-MB-435s細(xì)胞，通過重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的正義和反義CYP2J2轉(zhuǎn)染，主要進(jìn)行以下研究 1.1CYP2J2對MDA-MB-435s細(xì)胞增殖的影響：腫瘤是由于致瘤因素的作用，局部組織的細(xì)胞失去了對其正常生長的調(diào)控，導(dǎo)致異?？寺⌒栽錾?。正常細(xì)胞生長依賴錨泊，有密度依賴抑制或接觸抑制，腫瘤細(xì)胞則缺乏這種生長

6、限制，甚至可在半固體瓊脂中呈懸浮生長，不需要依附固定表面，不受密度限制，可持續(xù)分裂堆積生長。瓊軟脂克隆形成又叫錨泊不依賴生長，通過計數(shù)2-4周后軟瓊脂上的克隆數(shù)目來檢測細(xì)胞的增殖能力，細(xì)胞在這種半固態(tài)媒體上生長是表型改變的指標(biāo)之一，也是證明促有絲分裂能力的方法之一。因此我們利用軟瓊脂克隆形成試驗來觀察CYP2J2轉(zhuǎn)染后在軟瓊脂上形成克隆的能力。結(jié)果反義2J2轉(zhuǎn)染明顯抑制MDA-MB-435s在軟瓊脂上形成克隆的能力，與GFP組(10.7

7、5±2.753)和空白對照組(11.75±2.217)比較，反義2J2轉(zhuǎn)染組(3.25±2.217)形成的克隆數(shù)目少，直徑??；CYP2J2(19±3.7416)轉(zhuǎn)染則顯著促進(jìn)MDA-MB-435s細(xì)胞在軟瓊脂上形成克隆，且克隆較對照組和轉(zhuǎn)染GFP組明顯增大，而且數(shù)目多。 1.2CYP2J2對MDA-MB-435s細(xì)胞黏附于細(xì)胞外基質(zhì)的影響：腫瘤的浸潤過程首先是腫瘤細(xì)胞黏附并降解細(xì)胞外基質(zhì)，然后遷移穿過細(xì)胞外基質(zhì)。我們選取細(xì)胞外基

8、質(zhì)主要成分之一纖維粘連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)來研究表氧化酶及其產(chǎn)物對腫瘤細(xì)胞黏附的影響。結(jié)果表明，與對照組比較，轉(zhuǎn)染反義CYP2J2顯著抑制MDA-MB-435s細(xì)胞黏附于基質(zhì)成分黏附細(xì)胞數(shù)約是對照組的50％，而轉(zhuǎn)染CYP2J2使其過表達(dá)表氧化酶則顯著促進(jìn)MDA-MB-435s細(xì)胞黏附(P＜0.05)。用表氧化酶代謝花生四烯酸產(chǎn)物EETs預(yù)處理MDA-MB-435s半小時也顯著的促進(jìn)MDA-MB-435s細(xì)胞黏附，而表氧化

9、酶抑制劑能顯著抑制MDA-MB-435s細(xì)胞的黏附(P＜0.01)。 1.3CYP2J2對MDA_MB-435s細(xì)胞游走遷移的影響：細(xì)胞的游走遷移是腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的一個重要步驟。我們利用改良的Boyden趨化小室研究CYP2J2對MDA-MB-435s細(xì)胞游走遷移的影響。實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染反義CYP2J2的MDA-MB-435s細(xì)胞穿過多聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)下降49％，而轉(zhuǎn)染正義CYP2J2的細(xì)胞穿過多聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)幾乎為對照組的

10、兩倍，外源性應(yīng)用表氧化酶抑制劑(17-ODYA)明顯抑制MDA-MB-435s細(xì)胞的遷移，而三種EETs顯著促進(jìn)MDA-MB-435s細(xì)胞遷移。 1.4CYP2J2對腫瘤轉(zhuǎn)移影響的在體實驗研究及其可能機制：為了觀察表氧化酶基因2J2是否影響腫瘤的在體轉(zhuǎn)移能力，我們用rAAV-2J2、rAAV-anti2J2和rAAV-GFP感染MDA-MB-435s細(xì)胞，3天后接種至雌性裸鼠腋窩皮下，觀察腫瘤生長情況。12周后處死裸小鼠，bou

11、in'ssolution固定肺組織，觀察比較肺部轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)數(shù)目。結(jié)果顯示CYP2J2轉(zhuǎn)染后的腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)生長迅速，腫瘤結(jié)節(jié)出現(xiàn)的平均時間明顯提前，瘤結(jié)節(jié)體積與對照組比較體積明顯增大；轉(zhuǎn)染反義CYP2J2的腫瘤細(xì)胞在體生長緩慢，腫瘤結(jié)節(jié)出現(xiàn)時間延遲，平均瘤結(jié)節(jié)體積比對照組明顯減小，其中有三只在12周末仍然沒有長出可以目測的移植瘤，與對照組比較差別有顯著性意義(P＜0.05)。接著我們觀察了腫瘤在肺部的轉(zhuǎn)移情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CYP2J2顯著促

12、進(jìn)了腫瘤的肺轉(zhuǎn)移，肺組織表面肉眼能見的瘤結(jié)節(jié)數(shù)目為對照組的2.8倍，反義CYP2J2組則沒有觀察到明顯的肺轉(zhuǎn)移。以上結(jié)果顯示CYP2J2具有促惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。 在此基礎(chǔ)上，我們研究了CYP2J2和EETs促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的可能機制，用Westernblot方法檢測EETs干預(yù)和表氧化酶基因轉(zhuǎn)染對轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)的影響，同時還用GelatinZymography方法檢測了CYP2J2對MMPs分泌的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CYP2J2促進(jìn)M

13、MP-2的分泌；反義CYP2J2則抑制MMP-2的分泌；EETs和CYP2J2明顯上調(diào)CD44的表達(dá)，下調(diào)nm23和CD82/KAI的表達(dá)，反義CYP2J2或CYP抑制劑則顯著下調(diào)CD44的表達(dá)，上調(diào)nm23和CD82/KAI的表達(dá)。 2.花生四烯酸表氧化酶抑制劑(17-ODYA)對人舌鱗癌裸鼠移植瘤抑瘤效應(yīng)的實驗研究 將人舌鱗癌細(xì)胞系(Tca8113)接種至BALB/c(nu/nu)裸鼠，建立人舌鱗癌裸鼠移植瘤模型，設(shè)

14、立陰性對照組(N.S)、陽性對照組(5-FU30mg/kg)、低劑量抑制劑組(0.5mg/只)、高劑量抑制劑組(1mg/只)和聯(lián)合用藥組(0.5mg/只17-ODYA+30mg/kg5-FU)，觀察腫瘤的生長狀態(tài)，計算抑瘤率；觀察移植瘤的組織病理學(xué)及超微結(jié)構(gòu)改變。結(jié)果與陰性對照組比較，花生四烯酸表氧化酶抑制劑(17-ODYA)組裸鼠皮下移植瘤體積明顯縮小(P＜0.01)，移植瘤的生長明顯受到抑制；高劑量組平均腫瘤體積與低劑量組比較，抑制

15、作用更明顯，但兩者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；17-ODYA組與陽性對照組相比，高劑量抑制劑組腫瘤平均體積減小不如陽性對照組明顯，但兩組之間無統(tǒng)計學(xué)差異；聯(lián)合用藥組與其他組相比腫瘤明顯受到抑制(P＜0.01)。瘤結(jié)節(jié)的重量比較與瘤結(jié)節(jié)體積結(jié)果一致。 結(jié)論： 我們的研究結(jié)果顯示①CYP2J2及其代謝花生四烯酸的下游產(chǎn)物EETs在促進(jìn)腫瘤的惡性增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附以及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞游走運動能力等多個環(huán)節(jié)促進(jìn)惡性腫瘤轉(zhuǎn)

16、移，同時還可能與促進(jìn)MMPs的分泌、上調(diào)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因CD44的表達(dá)、下調(diào)轉(zhuǎn)移抑制基因CD82/KAI和nm23的表達(dá)有關(guān)。 ②花生四烯酸細(xì)胞色素P450表氧化酶抑制劑(17-ODYA)對人舌鱗癌裸鼠移植瘤有明顯的抑瘤效應(yīng)，但是其作用機制、毒副作用以及與其他臨床化療藥物聯(lián)合的療效尚需進(jìn)一步的研究?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)為惡性腫瘤的基因治療提供了新的靶點，為開發(fā)新的抗癌藥物提供了理論基礎(chǔ)。但是惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多因素多步驟的過程，CY