1、研究背景：
　　急性呼吸道感染（Acute respiratory tract infection，ARTI）在各年齡段兒童中是一種常見疾病，尤其在小于5歲兒童中常見。ARTI癥狀輕者可表現(xiàn)為扁桃體炎，較嚴重者可因重癥肺炎及其并發(fā)癥導致死亡，其高住院率及死亡率為社會帶來沉重負擔。急性呼吸道感染的主要病原體，以呼吸道病毒為主，呼吸道病原體混合感染在兒童ARTI中的檢出率在30％至50%不等，準確地檢測呼吸道感染的病原體，對于臨床合理

2、用藥治療具有重要意義。目前，臨床實驗室主要采用熒光定量PCR（ Realtime quantitative PCR，qPCR）方法，人工提取核酸耗時較長且無法在一次反應中同時檢測多達十余種病原體。隨著多重PCR技術的成熟，市面上逐漸出現(xiàn)商品化的多重PCR檢測體系，如Filmarray呼吸道病原體檢測平臺，是基于巢式多重qPCR方法的呼吸道病原體快速檢測平臺，可在70分鐘內于密閉反應條中自動完成核酸提取、逆轉錄、qPCR步驟，檢測1份樣本

3、中18種呼吸道病原體，雖其成本較高，但具有不依賴PCR實驗室條件、快速、病原譜廣的優(yōu)點，適合應用于門診的急重癥患者；海爾施呼吸道病原體多重檢測體系，是基于多重PCR及毛細管電泳分離法的檢測體系，依賴于PCR實驗室條件及人工操作，在一次反應中可同時對180份樣本完成共14種常見呼吸道病原體的檢測，具有通量大、成本低的特點。這些多重PCR檢測體系，都有助于實現(xiàn)臨床實驗室在短時間內完成對多種呼吸道病原體的檢測，但尚未獲得CFDA認證，需開展臨

4、床應用及評估，以盡快投入臨床檢測中使用。
　　腺病毒（Adenovirus，ADV）作為一種兒童急性呼吸道感染常見病原體，在各地區(qū)ARTI兒童中的檢出率由5%至25%不等，且主要在5歲以下兒童檢出。有研究發(fā)現(xiàn)，從重癥肺炎患兒中分離的腺病毒較多見的為7型腺病毒（ADV-7），推斷ADV-7與兒童重癥肺炎有密切關系，然而，對不同血清型腺病毒引起的臨床癥狀作系統(tǒng)、大量數(shù)據(jù)分析的研究仍然較少見，且研究入組例數(shù)較少，不足以明確ADV-7較其

5、余血清型更易引起兒童重癥肺炎，ADV-7在重癥肺炎中的致病機制尚未明確。
　　研究目的：
　　1.評估多重呼吸道病原體分子檢測體系的臨床應用，旨在為臨床檢驗實驗室針對不同需求的患者應用快速、準確的檢測方法提供參考。
　　2.通過調查呼吸道感染住院兒童中常見病原體的流行情況、混合感染檢出率及混合感染與疾病嚴重程度的關系，在兒童ARTI病因學方面為臨床提供參考；探討上呼吸道、下呼吸道樣本中檢出病原體的相關性，為臨床采樣方法

6、的選擇提供科學依據(jù)。
　　3.探討各血清型腺病毒在呼吸道感染住院兒童中的流行情況、不同血清型與患兒臨床病情發(fā)展的相關性，明確重癥患者腺病毒基因組特征，為腺病毒致病機制的研究提供流行病學資料。
　　研究方法：
　　1.建立分別針對常見呼吸道病原體的檢測體系，包括甲型流感病毒（Influenza A virus，IFA）、乙型流感病毒（Influenza B virus，IFB）、1~4型人副流感病毒（Parainflue

7、nza virus，PIV），呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）、腺病毒（Adenovirus，ADV）、鼻病毒（Rhinovirus，RV）、腸道病毒（Enterovirus，EV）、人偏肺病毒（Human metapneumovirus，HMPV）、冠狀病毒（Coronavirus， CoV）OC43，CoV NL63，CoV229E、CoV HKU1、肺炎支原體（ Mycoplasma

8、 pneumoniae，MP）、肺炎衣原體（Chlamydia pneumoniae，CP）、百日咳桿菌（Bordetella pertussis，BP）18種常見呼吸道病原體的自建熒光定量PCR（Realtime quantative PCR，qPCR）檢測體系，與基于巢式多重qPCR法的Filmarray，及基于多重PCR和毛細管電泳方法的海爾施14種呼吸道病原體多重檢測體系，共三種檢測體系，共同檢測55例診斷為急性呼吸道感染住院兒

9、童55份NPS及30份BALF中的病原體。比較三種檢測體系的結果，分析各病原體及混合感染的檢出率、混合感染與臨床特征的關系，并研究患兒上、下呼吸道樣本檢測結果相關性。
　　2.對2014年6月至2016年8月期間廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院及廣州市婦女兒童醫(yī)院共240例住院患兒的腺病毒陽性核酸樣本，以qPCR及一代測序方法進行血清型分型，統(tǒng)計各血清型檢出率。收集所有患兒臨床特征資料，分析不同血清型ADV與ARTI患兒臨床特征的相關性。

10、
　　3.通過基于高通量測序技術的宏基因組學方法，獲得腺病毒感染重癥患者7型ADV全基因組序列，對ADV-7全基因組及各個主要功能基因作基因突變和進化分析。
　　研究結果：
　　1.Filmarray共從41例（74.5%）ARTI住院患兒的NPS中檢出至少1種呼吸道病原體，混合感染的檢出率為40%（22/55）。RV為檢出率最高的病原體，其次為MP和RSV，RV與MP合并感染為最常見混合感染模式。單一病原體感染與混合

11、感染患兒的臨床特征差異未見統(tǒng)計學意義。共76.7%患兒（23/30）NPS樣本中檢出的病原體可包括其BALF中檢出的病原體，53.3%（16/30）患兒NPS與BALF中檢出的病原體完全一致。通過Filmarray、海爾施、自建qPCR檢測體系均得到基本相符結果。Filmarray與自建qPCR檢測結果一致率達84.7%，海爾施與自建qPCR檢測結果一致率達75.4%。
　　2.3型腺病毒為2014年至2016年主要流行的腺病毒血

12、清型，占77.5%，其次為7型腺病毒，占20.4%。ADV-7感染患兒中2歲以下兒童比例高于ADV-3感染患兒，且 ADV-7感染患兒的肺炎、重癥肺炎、并發(fā)癥、胸腔積液、需機械輔助通氣發(fā)生率顯著高于ADV-3感染患兒（P＜0.01）。
　　3.通過高通量測序，組裝獲得1例重癥肺炎患者7型腺病毒全基因組序列，與基因數(shù)據(jù)庫中ADV-7基因組比較，未發(fā)現(xiàn)該例ADV-7存在大片段變異。通過進化分析發(fā)現(xiàn)，ADV-7全基因組與2011年廣州地

13、區(qū)一例重癥死亡病例中分離的ADV-7同源性最高，ADV-7全基因組及Hexon、Fiber、E3區(qū)域基因與近年來中國地區(qū)ADV-7均有高度同源性。本研究 ADV-7全基因組與2011年廣州地區(qū)重癥死亡病例的ADV-7全基因組相比，在轉錄相關蛋白55 kDa外顯子1發(fā)現(xiàn)一處C3218A堿基突變，為同義突變。
　　研究結論：
　　三種呼吸道病原體檢測體系的檢測結果相互之間基本相符，方便臨床為不同需求患者提供適宜的檢測體系。三種檢

14、測體系共同驗證了混合感染在急性呼吸道感染住院患兒中有較高的檢出率，但與臨床特征的相關性需要進一步研究。上、下呼吸道樣本中病原體有較高一致性，采集鼻咽拭子進行檢測可一定程度預測下呼吸道病原體，有簡便、無創(chuàng)的優(yōu)勢。3型腺病毒在2014年至2016年為主要流行血清型，而7型腺病毒與兒童重癥肺炎有密切關系。7型腺病毒全基因組及各主要功能基因均高度保守，未發(fā)生明顯突變。7型腺病毒并非通過突變引起兒童重癥肺炎，其在嗜性、復制能力、及引起宿主免疫反應